食品微生物快速檢驗(yàn)和無菌操作技術(shù)

司福龍

摘 ? 要：在食品質(zhì)量檢驗(yàn)過程中，要根據(jù)實(shí)際情況合理選用阻抗法、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、DNA芯片技術(shù)、ATP生物熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)等進(jìn)行食品微生物檢驗(yàn)。在檢驗(yàn)過程中，必須樹立無菌操作觀念，規(guī)范無菌操作程序，在取樣、樣品前處理、純種分離、革蘭氏染色等過程中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作技術(shù)，順利完成食品微生物檢驗(yàn)工作，確保人群健康。

關(guān)鍵詞：微生物檢驗(yàn) ?食品檢驗(yàn) ?快速檢驗(yàn)技術(shù) ?無菌操作技術(shù)

中圖分類號：TS207 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：1674-098X（2019）02（a）-0125-02

食品微生物污染與人體健康息息相關(guān)，采用先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確、有效的檢驗(yàn)有利于維護(hù)人群健康。傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)以染色、培養(yǎng)和生化鑒定等為主，結(jié)果比較可靠，為食品微生物檢驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但細(xì)菌生長繁殖需要消耗一定時間，應(yīng)及時檢測;同時病原體培養(yǎng)還與營養(yǎng)、抗生素使用和病原體含量等因素相關(guān)。隨著現(xiàn)代科學(xué)和物理化學(xué)、分子生物、免疫學(xué)等檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，快速微生物檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用。無菌操作是微生物檢驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)，在食品微生物檢驗(yàn)時，檢驗(yàn)人員必須樹立無菌操作觀念，規(guī)范無菌操作程序，才能順利完成食品微生物檢驗(yàn)工作。

1 ?食品微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)

1.1 阻抗法

微生物在培養(yǎng)基中生長繁殖會引起電特性變化，阻抗法是利用電變化特性來間接測定食品中微生物含量的一種檢測技術(shù)，能夠檢測食品中絕大部分食品微生物。微生物能將培養(yǎng)基中的惰性大分子營養(yǎng)素分解為具有微電活性小分子物質(zhì)，根據(jù)不同生長期微生物濃度與培養(yǎng)基電阻性之間的線性關(guān)系，通過培養(yǎng)基電阻抗的檢測值可推算出食品樣本微生物的濃度。

1.2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）

該技術(shù)的基本原理是通過體外酶促反應(yīng)高效合成特異性的雙鏈DNA片斷，之后通過擴(kuò)增產(chǎn)物識別不同的細(xì)菌，由于在體外完成DNA片段擴(kuò)增，故又稱基因體外擴(kuò)增法。

PCR技術(shù)具有較高的靈敏度，且耗費(fèi)時間較短，理論上能檢出一個細(xì)菌的拷貝基因，通過PCR技術(shù)在短時間增菌甚或不增菌的情況下即可篩選檢測細(xì)菌。

PCR技術(shù)的缺點(diǎn)主要表現(xiàn)在：（1）出現(xiàn)假陰性結(jié)果。原因在于食物標(biāo)本、增菌培養(yǎng)基和其他微生物DNA可能抑制Taq酶活性;（2）出現(xiàn)假陽性結(jié)果。PCR操作過程嚴(yán)格，微量外源性DNA混入食品樣本可得到無限放大;（3）影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，由擴(kuò)增過程裝配誤差所致。

食品微生物檢測可應(yīng)用PCR全自動檢測儀，這不僅可以克服手工操作的缺點(diǎn)，還能提高檢測結(jié)果的敏感性和特異性。

1.3 DNA芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)具有廣闊的發(fā)展前景和空間。生物芯片是基于玻片和尼龍膜等載體，有序排列很多生物活性分子。這些分子在單位面積上密度較高，在一次試驗(yàn)下就能同時檢測多種食品樣本及其中的多種病原微生物。

根據(jù)芯片固定生物活性分子的不同，可分為蛋白芯片和基因芯片兩種類型，寡核苷酸探針或靶DNA為基因芯片的活性分子。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，DNA芯片具有少樣品需求、可快速準(zhǔn)確高效地顯示病原體遺傳信息，已被廣泛應(yīng)用在分析宰基因序列、快速診斷病原微生物感染、研究變異和耐藥機(jī)制、揭示發(fā)病機(jī)制以及感染性疾病的診斷和治療等。

1.4 ATP生物熒光技術(shù)

ATP是一種高能磷酸化合物，含量相對穩(wěn)定，普遍存在于各種細(xì)菌細(xì)胞中，并且是所有生物生命活動的最終能量來源。ATP生物熒光技術(shù)的原理是在熒光素酶的催化作用下，通過ATP激活熒光素并與氧結(jié)合，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，釋放光量子。通過ATP不斷提供能量，不斷激活熒光分子，ATP濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。為降低外界干擾，增強(qiáng)特異性識別微生物能力，提高檢測靈敏度和檢測效率，應(yīng)選取合適的ATP提取劑。

ATP生物熒光技術(shù)不需微生物培養(yǎng)，可在幾分鐘內(nèi)得到檢測結(jié)果，普遍應(yīng)用于肉制品雜菌污染鑒定、飲料和調(diào)味品微生物檢測等。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

該技術(shù)是應(yīng)用最廣泛的酶免疫測定技術(shù)，其原理是在固相載體吸附抗原或抗體并行免疫酶染色，在酶作用下出現(xiàn)顯色反應(yīng)，之后運(yùn)用定性或定量方法分析有色產(chǎn)物量，進(jìn)而確定樣品中待測物質(zhì)的含量，是一種特異性和敏感性較高的食品微生物檢測方法。

雙抗體夾心法、間接法、捕獲法、競爭法是常用的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，可用于檢測食品中沙門氏菌、大腸桿菌、彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌等微生物，檢測食品標(biāo)本數(shù)量可達(dá)上千份，具有成本低、反應(yīng)靈敏、適用范圍廣、定量和檢測速度快等優(yōu)勢。

2 ?食品微生物檢驗(yàn)的無菌操作技術(shù)

2.1 取樣

食品微生物檢驗(yàn)是無菌稱取要求檢驗(yàn)的樣本質(zhì)量，取樣過程中要使用消毒天平，剪刀、藥匙等檢驗(yàn)用品要經(jīng)170℃/2h干熱滅菌。取樣過程要嚴(yán)格按照無菌操作技術(shù)，切實(shí)保證樣品原始狀態(tài)。

2.2 樣品前處理

取樣后要行樣品前處理，整個過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作技術(shù)。一般稱取25g樣品于盛有225mL無菌稀釋液無菌均質(zhì)袋中均質(zhì)，制備成1：10樣品勻液進(jìn)行檢驗(yàn)。對計(jì)數(shù)樣品要制備10倍系列稀釋樣品勻液，按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》（GB4789.2-2016）要求完成樣品前處理操作。

2.3 純種分離

為準(zhǔn)確確定食品標(biāo)本微生物群體，檢驗(yàn)時要從混雜樣品中分離出疑似目標(biāo)菌，進(jìn)而得到純培養(yǎng)物。為促進(jìn)目標(biāo)微生物生長繁殖，要根據(jù)微生物不同特性針對性選擇培養(yǎng)基并設(shè)定適宜培養(yǎng)條件;或通過應(yīng)用相應(yīng)抑制素，抑制除目標(biāo)菌以外的雜菌生長繁殖，進(jìn)而淘汰其他雜菌，進(jìn)而將培養(yǎng)物接種在固體培養(yǎng)基上形成目標(biāo)菌的單菌落。按要求純化與鑒定單菌落，保證分離到純菌株。

在整個分離純化過程中，通常需要用接種環(huán)把微生物的純培養(yǎng)物從一個器皿轉(zhuǎn)接到另一個器皿中培養(yǎng)。如此時未嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作技術(shù)，很難保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時，檢驗(yàn)人員應(yīng)加強(qiáng)自身實(shí)驗(yàn)水平與操作能力，確保無菌操作技術(shù)熟練準(zhǔn)確，不斷提高自身綜合能力。

2.4 革蘭氏染色

革蘭氏染色是食品微生物確認(rèn)鑒定的重要方法，將疑似目標(biāo)菌經(jīng)過純化分離后染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察微生物形態(tài)，能初步鑒定微生物是否為所檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)菌。涂片—初染—媒染—脫色—復(fù)染為革蘭氏染色的操作步驟，涂片是最重要最關(guān)鍵的步驟，涂片過程中必須嚴(yán)格無菌操作技術(shù)，避免混入雜菌，影響鏡檢結(jié)果。

2.5 空白對照

按照GB4789.2-2016要求，在有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)皿中加入1mL空白稀釋液作為空白對照，這是保證檢驗(yàn)結(jié)果真實(shí)有效的關(guān)鍵措施。

空白對照結(jié)果可直接反映檢驗(yàn)用品、無菌室空氣條件和操作人員是否符合無菌操作的要求，即檢驗(yàn)過程中所使用檢驗(yàn)用品是否已徹底滅菌、無菌室空氣條件是否滿足既定標(biāo)準(zhǔn)、操作人員是否規(guī)范完成無菌操作技術(shù)。只有空白對照結(jié)果符合要求，才能獲得可靠有效的檢驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，在食品質(zhì)量檢驗(yàn)過程中，要根據(jù)實(shí)際情況合理選用阻抗法、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、DNA芯片技術(shù)、ATP生物熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)等進(jìn)行食品微生物檢驗(yàn)。在檢驗(yàn)過程中，必須樹立無菌操作觀念，規(guī)范無菌操作程序，在取樣、樣品前處理、純種分離、革蘭氏染色等過程中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作技術(shù)，順利完成食品微生物檢驗(yàn)工作，確保人群健康。

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