凡納濱對蝦源氣單胞菌的分離鑒定及群體感應

于紅雷，韓云艷，曾名湧，劉尊英

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003)

細菌利用信號分子進行交流的方式稱為群體感應(quorum sensing，QS)。細菌分泌的信號分子是一種自誘導物(autoinducers，AIs)，當自誘導物的濃度達到一定閾值時，會被特定的受體識別，從而啟動下游基因的表達并調控細菌的群體行為[1]。 目前研究表明，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都存在群體感應系統，革蘭氏陰性菌主要以酰化高絲氨酸內酯(N-acyl homoserine lactone，AHLs)作為信號分子，而革蘭氏陽性菌則采用被修飾過的寡肽類(autoinducing peptides，AIPs)為信號分子。QS在調節細菌的群體行為和生理功能中發揮著重要作用，比如生物發光、生物膜的形成、毒力基因的表達和致腐能力等[2-3]。近年來，越來越多的研究表明食物腐敗與細菌的QS有關，Fu等[4]研究發現QS可以控制波羅的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)腐敗相關基因的表達，Christensen等[5]報道了SerratiaproteamaculansB5a的腐敗行為受QS調節，并且S.proteamaculansB5a的sprI(負責產生AHLs)突變體失去對牛奶的腐敗能力。

氣單胞菌(Aeromonasspp.)是革蘭氏陰性菌，廣泛存在于海水、池塘等水生環境中，是一種導致胃腸炎和敗血癥的人畜共患條件致病菌，氣單胞菌分泌AHLs類信號分子并且調控其毒力基因的表達[6-7]。氣單胞菌在凡納濱對蝦和大黃花魚的腐敗過程中發揮重要作用[3,8]，并且綠薄荷精油通過抑制溫和氣單胞菌AHLs的分泌降低了腐敗能力(胞外蛋白酶活性)[9]。因此，本研究中，筆者擬從冷藏凡納濱對蝦中篩選、鑒定氣單胞菌，并研究氣單胞菌的群體感應特性，以期闡明氣單胞菌的致腐機制及實現對水產品腐敗的精準控制。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株和培養條件

AHLs標準品，Sigma 公司；偶氮酪蛋白、壯觀霉素、四環素、卡那霉素、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)，Solarbio 公司；RP-C18反相薄層板，Merck 公司；細菌基因組提取試劑盒，北京全式金公司；LB液體培養基、RS鑒別培養基等相關培養基，青島海博生物技術有限公司；其余試劑均購自國藥集團試劑有限公司。

氣單胞菌、紫色桿菌(ChromobacteriumviolaceumCV026)和根癌農桿菌(AgrobacteriumtumefaciensA136)均在LB培養基中培養，培養條件為 30 ℃、160 r/min。根癌農桿菌培養體系需加入50 mg/L壯觀霉素和4.5 mg/L四環素，紫色桿菌培養體系需加入20 mg/L卡那霉素。

1.2 氣單胞菌的分離鑒定

冷藏凡納濱對蝦貯藏到貨架期終點時，選取蝦肉打漿，之后稀釋至適當梯度涂布于RS培養基中，于30 ℃培養24 h。挑取黃色菌落于LB液體培養基中培養純化，將分離純化后的菌株進行16S rRNA 測序、鑒定，然后通過NCBI數據庫比對并用MEGA6.0構建系統發育樹。

1.3 氣單胞菌群體感應信號分子 AHLs 的檢測

1.3.1 氣單胞菌AHLs粗提液的制備

將菌株在LB液體培養基中培養，30 ℃、180 r/min振蕩培養至一定的密度后，8 000 r/min離心5 min，取上清液，用等體積含0.5%(體積分數)甲酸的乙酸乙酯萃取3次，混合有機相旋蒸至干，溶于二甲亞砜，-20 ℃保存備用。

1.3.2 薄層層析(TLC)法檢測AHLs

將AHLs標品和樣品粗提液點樣于C18反相薄層板上，并以甲醇/水(體積比3∶ 2)展開，無菌風吹干，將紫色桿菌CV026與含0.7 %(質量分數)瓊脂的LB混合均勻，低于 42 ℃鋪于薄層層析(TLC)板上，凝固。30 ℃密閉容器中培養24～48 h，觀察顏色變化[10]。

1.3.3 AHLs含量檢測

將過夜活化的菌株按體積比1∶ 1 000接種于LB液體培養基中，于180 r/min、30 ℃培養。每隔 4 h 測OD600按照 1.3.1方法提取信號分子，-20 ℃保存備用。將AHLs提取物、A136裂解物和20 mmol/L的KH2PO4溶液均勻混合(體積比1∶ 1∶ 2)后，取200 μL混合液加入96孔板中，再加入X-gal(500 μg/mL)。30 ℃培養3 h，酶標儀檢測吸光值OD635。陰性對照加入等量二甲基亞砜(DMSO)，以β-半乳糖糖苷酶活性(OD635)表示AHLs的相對含量。

1.4 氣單胞菌生長曲線測定

將菌株接種于添加和未添加C4-HSL的AB培養基中，于30 ℃、180 r/min培養，每隔4 h測定菌落總數和OD600，繪制生長曲線。

1.5 氣單胞菌生物膜的測定

參照Peeters等[11]的方法，利用結晶紫染色法測定細菌的生物膜能力。將添加和未添加C4-HSL(10 μmol/L)的菌液于48孔酶標板中，30 ℃、180 r/min培養24 h。除去菌液，用蒸餾水清洗孔板3次，置于50 ℃烘箱烘干30 min，然后再加入1.2 mL質量分數1%的結晶紫，染色15 min，再用蒸餾水清洗每個孔3次后，加入1.2 mL體積分數95%的乙醇，靜置5 min，在570 nm處測定吸光值OD570，以吸光值大小表示生物膜形成量的多少。

1.6 氣單胞菌蛋白酶活力測定

蛋白酶測定用偶氮酪蛋白作為反應底物，將菌株接種于添加和未添加C4-HSL的LB培養基中，30 ℃、180 r/min培養24 h，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液作為粗酶液。反應體系為200 μL偶氮酪蛋白(20 mg/mL)和400 μL上清液，混合均勻后置于30 ℃水浴1 h，再加入600 μL三氯乙酸終止反應。對照組為先加入偶氮酪蛋白水浴，再加入三氯乙酸，最后加入上清液。然后再4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取500 μL上清液和等體積的NaOH(1 mol/L)混合，在440 nm處測定吸光值OD440，以吸光值大小表示蛋白酶活力的相對強弱。

2 結果與討論

2.1 氣單胞菌的分離鑒定結果

氣單胞菌的16S rRNA 基因瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1(a)所示。

由圖1(a)可知，其目的片段在1 800 bp左右。將得到的16S rRNA 基因序列通過 NCBI的BLAST系統進行序列相同性檢索，結果表明該菌為氣單胞菌屬(Aeromnasspp.)。

系統發育學分析結果如圖1(b)所示。由圖1(b)可知，該菌與Aeromonassp. J1.3E2親緣關系最近，相似性達 99.0%。因此，判定該菌為氣單胞菌屬，命名為Aeromonassp. A01。

Aer：Aeromonas spp.A01；M:基因Marker；分支上的數值代表為自舉1 000次的結果圖1 16S rRNA PCR 擴增產物電泳圖和系統發育樹 Fig.1 16S rRNA PCR amplified products electrophoresis of Aeromonas sp. A01 (a)； relationship between Aeromonas sp.A01 and other Aeromonas sp.(b)

2.2 Aeromonas sp. A01信號分子種類與含量分析

氣單胞菌屬細菌主要分泌C4-HSL和C6-HSL類信號分子[12-13]。本研究中，用TLC法檢測Aeromonassp. A01的種類和含量，結果如圖2所示。

由圖2(a)可知，氣單胞菌Aeromonassp. A01可產生C4-HSL，但未檢測到C6-HSL信號分子。由圖2(b)可知，隨氣單胞菌培養時間的延長，信號分子AHLs含量呈逐漸增加趨勢，且AHLs的含量自對數生長期顯著增加(P<0.05)，并在12 h左右達最高值，進入穩定期后，AHLs含量趨于穩定，這可能是細菌密度在對數生長期不斷增加，而穩定期保持不變造成的。

圖2 TLC法檢測Aeromonas sp. A01的AHLs 種類和含量 Fig.2 TLC analysis of AHLs secreted by Aeromonas sp. A01(a); the growth curve and AHLs activity of Aeromonas sp. A01(b)

2.3 外源信號分子C4-HSL對Aeromonas sp.A01生長、生物膜和蛋白酶的影響

為進一步探究Aeromonassp. A01的群體感應特性，本研究通過添加外源信號分子C4-HSL研究群體感應對Aeromonassp. A01生長、生物膜和蛋白酶的影響，結果如圖3和圖4所示。

由圖3可知，自對數生長期后期，外源C4-HSL(10 μmol/L)顯著促進了Aeromonassp. A01的生長(P<0.05)。表明Aeromonassp. A01可利用C4-HSL促進自身的生長，而細菌總數是衡量水產品腐敗的重要指標，Aeromonassp. A01可能通過利用QS促進自身生長進而加速水產品的腐敗。

圖3 外源信號分子C4-HSL對Aeromonas sp. A01 生長的影響 Fig.3 Effects of exogenous C4-HSL on the growth of Aeromonas sp. A01

腐敗菌分泌的蛋白酶會將食物蛋白質分解成小肽和氨基酸，并進一步氧化降解產生腐敗異味[14]。細菌蛋白酶活性高低可加快或延緩食品腐敗進程。細菌蛋白酶活性受細菌群體感應系統的調節，信號分子AHLs可顯著促進Pseudomonasfluorescens蛋白酶產生[15]，同時群體感應受體LuxO也會影響Vibriocholerae的蛋白酶活性[16]。由圖4可知，外源C4-HSL可提高Aeromonassp.A01蛋白酶活性，培養36 h后，其蛋白酶活性提高了20%。與對照差異達顯著水平(P<0.05)。

圖4 外源信號分子C4-HSL對Aeromonas sp. A01 蛋白酶活性和生物膜形成的影響 Fig.4 Effects of exogenous C4-HSL (10 μmol/L) on protease activity and biofilm formation of Aeromonas sp. A01 inculated for 36 h

細菌生物膜的形成代表了一種受保護的生長模式，它允許細菌在惡劣的環境中生存。生物膜形成通常受QS系統調控[17-18]。圖4結果證實，Aeromonassp.A01具有很強的生物膜形成能力，外源添加C4-HSL后，其生物膜形成能力提高了51%，與對照差異達極顯著水平(P<0.01)。由此推測，Aeromonassp. A01通過利用C4-HSL促進自身生物膜形成與蛋白酶分泌，進而增強抗逆性，加速水產品營養物質的降解，最終加速水產品的腐敗。

3 結論

從冷藏的凡納濱對蝦中成功分離出氣單胞菌，并命名為Aeromonassp.A01，其可產生C4-HSL類信號分子，且在對數生長期前后達最大值并在穩定期保持在較高水平。Aeromonassp.A01可利用外源信號分子C4-HSL調控自身生長，并能利用外源信號分子調控自身蛋白酶產生與生物膜形成。

冷藏凡納濱對蝦氣單胞菌生長、蛋白酶活性和生物膜形成與AHLs介導的群體感應密切相關，C4-HSL可促進氣單胞菌生長、生物膜形成能力和蛋白酶活性提高。因此，氣單胞菌的群體感應系統或群體感應信號分子可作為控制冷藏凡納濱對蝦腐敗的新靶點，但其詳細的作用機制還需進一步探究。