細(xì)菌群體感應(yīng)淬滅酶及其應(yīng)用研究進(jìn)展

常 晶，史國萃，曾名湧，劉尊英

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003)

細(xì)菌的群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)是細(xì)菌通過感知環(huán)境中的信號(hào)分子水平來調(diào)整自己群體密度和行為的過程，使細(xì)菌能夠通過群體依賴方式分泌的信號(hào)分子來交流和協(xié)調(diào)其行為和活動(dòng)[1]。細(xì)菌分泌的信號(hào)分子在環(huán)境中不斷累積，細(xì)菌“感知”這些信號(hào)分子的含量，當(dāng)信號(hào)分子的濃度達(dá)到臨界值時(shí)，細(xì)菌群體通過特異性靶基因的協(xié)同表達(dá)來響應(yīng)，一方面增強(qiáng)自身的防御能力，提高生存能力，另一方面卻會(huì)導(dǎo)致一些病原菌毒力因子和致病基因的表達(dá)，給農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、食品和制藥工業(yè)的發(fā)展帶來巨大的挑戰(zhàn)。群體感應(yīng)淬滅(quorum quenching,QQ)能夠抑制信號(hào)分子的合成和積累，或?qū)π盘?hào)分子進(jìn)行降解和修飾，破壞細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，從而阻斷腐敗菌或致病菌帶來的不利影響[2]。人們從原核生物和真核生物中鑒定出了一些群體感應(yīng)淬滅酶(quorum quenching enzymes)，這些群體感應(yīng)淬滅酶能夠降解信號(hào)分子，減輕或消除致病菌的致病性[3]。N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶(AHL內(nèi)酯酶)作為廣泛存在的群體感應(yīng)淬滅酶，表現(xiàn)出了很強(qiáng)的淬滅活性。本文中，筆者重點(diǎn)闡述AHL內(nèi)酯酶的研究現(xiàn)狀及群體感應(yīng)淬滅應(yīng)用的研究現(xiàn)狀，旨在為群體感應(yīng)淬滅資源的深入挖掘和應(yīng)用提供理論參考。

1 群體感應(yīng)淬滅途徑

根據(jù)群體感應(yīng)系統(tǒng)的組成和特點(diǎn)，對(duì)QS的淬滅大致有以下3種途徑：①阻礙信號(hào)分子合成蛋白的產(chǎn)生，從源頭上使信號(hào)分子無法生成[4]；②降解信號(hào)分子，使信號(hào)分子濃度始終處于臨界值以下，無法調(diào)控下游基因的表達(dá)[5]；③阻止信號(hào)分子與受體蛋白的結(jié)合,使之不能行使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的功能[6]。群體感應(yīng)淬滅酶和一些小分子抑制劑(quorum sensing inhibitors,QSI)作為2種最主要的群體感應(yīng)淬滅手段，分別通過降解信號(hào)分子以及阻斷信號(hào)的產(chǎn)生和識(shí)別起到淬滅的作用。目前關(guān)于群體感應(yīng)抑制劑的研究和相關(guān)綜述已很多，本文中，筆者重點(diǎn)綜述群體感應(yīng)淬滅酶這條途徑的具體淬滅原理。

2 群體感應(yīng)淬滅酶

許多動(dòng)植物病原菌如銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、歐文氏胡蘿卜軟腐病菌(Erwiniacarotovora)和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)等都依賴于N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯(AHLs)的累積調(diào)控致病因子、生物膜等的表達(dá)[7]。目前已知的AHLs信號(hào)分子超過40種，AHLs信號(hào)分子雖然鏈長不同，N-酰基側(cè)鏈上的取代基也不同，但是它們都有一個(gè)高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和酰胺鍵，這就為群體感應(yīng)淬滅酶提供了相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(表1)。根據(jù)AHL淬滅酶催化機(jī)制的不同，又將其分為3類：AHL內(nèi)酯酶、AHL酰胺酶和AHL氧化還原酶。

表1 AHLs的結(jié)構(gòu)式

2.1 AHL內(nèi)酯酶

AHL內(nèi)酯酶是群體感應(yīng)淬滅酶中研究最廣泛和最深入的，首個(gè)被確定為群體感應(yīng)淬滅酶的酶就是由aiiA編碼的內(nèi)酯酶。AHL內(nèi)酯酶能夠水解AHLs的內(nèi)酯環(huán)，產(chǎn)生N-酰基高絲氨酸，在酸性條件下，N-酰基高絲氨酸能夠重新環(huán)化成AHLs，因此AHL內(nèi)酯酶的淬滅是可逆的。2000年，Dong等[8]首次在芽孢桿菌(Bacilluscereus)240B1中分離出內(nèi)酯酶AiiA240B1。隨后研究發(fā)現(xiàn)，大部分芽孢桿菌都含有內(nèi)酯酶AiiA。Grage等[9]發(fā)現(xiàn)了短小芽孢桿菌能夠降解信號(hào)分子，這是首次以短小芽孢桿菌作為群體淬滅細(xì)菌進(jìn)行報(bào)道，隨后研究者從短小芽孢桿菌中分離得到AHL內(nèi)酯酶AdeH[9]。除了在芽孢桿菌中廣泛存在，AHL內(nèi)酯酶還存在于節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)[10]、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)[11]和金黃桿菌屬(Chryseobacteriumsp.)[12]等不同種屬中。

2.1.1 AHL內(nèi)酯酶分類

根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)及酶活特點(diǎn)，AHL內(nèi)酯酶分為不同的蛋白家族，不同的蛋白家族又包含多種具有同源性的酶。如金屬-β-內(nèi)酰胺酶家族、α/β水解酶家族、對(duì)氧磷酶家族、酰胺水解酶家族和糖基水解酶家族等。AHL內(nèi)酯酶的詳細(xì)信息見表2。

表2 AHL內(nèi)酯酶的分類及來源

2.1.2 AHL內(nèi)酯酶的酶學(xué)特性

AHL內(nèi)酯酶與其他酶一樣，對(duì)溫度、pH等都有著嚴(yán)格的要求。AHL內(nèi)酯酶是一種酸性蛋白，含有250個(gè)氨基酸殘基，分子量為2.8×104，等電點(diǎn)為4.7，對(duì)溫度比較敏感。在28 ℃保溫30 min，酶活力仍保持81.8%；但當(dāng)溫度超過37 ℃時(shí)，酶活急劇下降；45 ℃保溫30 min，酶活基本喪失。在pH6～8范圍內(nèi)，酶的活性變化不明顯，超過這個(gè)范圍，酶活性下降甚至消失[27]。

與其他內(nèi)酯酶結(jié)構(gòu)上具有2條反向平行的β折疊不同，AHL內(nèi)酯酶含有3條β折疊，特定的分子結(jié)構(gòu)決定AHL內(nèi)酯酶的酶學(xué)性質(zhì)有其自身的特點(diǎn)。2004年，Wang等[28]對(duì)AHL內(nèi)酯酶的特異性和酶動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)AHL內(nèi)酯酶對(duì)非酰基內(nèi)酯和非環(huán)內(nèi)酯沒有或有很少的淬滅活性，但對(duì)長度和酰基側(cè)鏈取代基不同的AHLs顯示出了很強(qiáng)的淬滅活性。研究還發(fā)現(xiàn)，盡管AHL內(nèi)酯酶攜帶有與其他金屬水解酶相同的104HXHXDH109短序列，該序列能夠與Zn2+構(gòu)成酶的活性中心，但Zn2+并不會(huì)對(duì)酶活性起很大的促進(jìn)作用；通過圓二色性光譜和定點(diǎn)突變對(duì)酶的活性和構(gòu)象進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，His-106、ASP-108、His-109和His-169都是酶發(fā)揮活性所必需的，缺一不可。

2.1.3 AHL內(nèi)酯酶的高效表達(dá)

AHL內(nèi)酯酶是一種胞內(nèi)酶，不能分泌到胞外直接作用于環(huán)境中的信號(hào)分子，為了使其能夠高效表達(dá)，現(xiàn)在普遍采用的方法是從分子水平進(jìn)行基因改造。改造途徑涉及以下幾個(gè)方面：①構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物。將克隆得到的AHL內(nèi)酯酶基因?qū)胂鄳?yīng)的植物中，達(dá)到防治植物細(xì)菌病害的目的。2007年，畢鑫莉等[29]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,將來自蘇云金芽胞桿菌的aiiA基因?qū)牖в蠛?魔芋抗軟腐病的能力得到大大提高；② 將AHL內(nèi)酯酶基因?qū)氘a(chǎn)AHLs的革蘭式陰性菌中表達(dá)，從而減少革蘭氏陰性菌產(chǎn)AHLs的量，抑制植物病變。Zhang等[30]將aiiA基因?qū)肷忱资骄校忱资骄腁HLs表達(dá)量降低，將其接種于太子參根部，太子參的根腐病、枯萎病顯著減弱；③ 構(gòu)建原核表達(dá)載體使AHL內(nèi)酯酶在原核系統(tǒng)中表達(dá)，但所用的質(zhì)粒載體各有所不同。2005年，溫曉芳[31]從蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)中克隆出aiiA基因與載體質(zhì)粒pQE-30連接，并在大腸桿菌M15中表達(dá)。2009年，張峰[32]將克隆得到的aiiA基因與載體質(zhì)粒pET29a相連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)后，得到大量可溶性目的蛋白；④構(gòu)建真核表達(dá)載體使AHL內(nèi)酯酶在真核系統(tǒng)中表達(dá)。陳瑞東[33]將aiiA連接pPIC9表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，畢赤酵母明顯提高了AHL內(nèi)酯酶的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的高效表達(dá)。無論是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物還是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，AHL內(nèi)酯酶都得到了高效表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)信號(hào)分子的降解，在抑制植物病變、改善水產(chǎn)品病原菌感染等方面顯示出了重要的作用。

2.2 AHL酰胺酶

AHL酰胺酶能夠破壞AHLs的酰胺鍵，產(chǎn)生高絲氨酸內(nèi)酯，這個(gè)過程是不可逆的。2000年，Leadbetter等[34]在爭論貪噬菌(Variovoraxparadoxus)中首次發(fā)現(xiàn)了AHL酰胺酶。2014年，Ochiai等[35]從不動(dòng)桿菌屬的基因組中克隆了amiE基因作為AHL降解基因，高效液相色譜分析顯示AmiE能夠水解AHLs的酰胺鍵，表現(xiàn)出AHL酰胺酶的能力。其中，AmiE顯示出對(duì)具有長酰基鏈的AHL的高水平降解活性，但對(duì)具有短于8個(gè)碳的酰基鏈的AHL沒有活性。同樣，AiiD對(duì)AHLs具有特異性，僅對(duì)長酰基鏈的AHLs具有降解活性[36]。除了細(xì)菌中有AHL酰胺酶外，研究發(fā)現(xiàn)一些放線菌和淡水藻類中也含有AHL酰胺酶。Park等[37]在放線菌鏈霉菌(Streptomycessp.)中發(fā)現(xiàn)ahlM基因可以調(diào)控AHLs的降解，質(zhì)譜分析表明AhlM可以水解AHL的酰胺鍵，釋放高絲氨酸內(nèi)酯。AiiC是從魚腥草屬中發(fā)現(xiàn)的由all3924編碼的酰基轉(zhuǎn)移酶，研究發(fā)現(xiàn)，這種藻類的細(xì)胞原液能夠降解AHLs，而且側(cè)鏈取代基不會(huì)影響其淬滅活性[38]，這種酶表現(xiàn)出更強(qiáng)的應(yīng)用前景。

2.3 AHL氧化還原酶

目前，對(duì)AHL氧化還原酶的研究比較少。AHL氧化還原酶可以催化氧化或還原AHLs。CYP102A1，一種被廣泛研究的巨大芽孢桿菌細(xì)胞色素P450，能夠非常有效地氧化AHL及其內(nèi)酯分解產(chǎn)物酰基高絲氨酸。類似于CYP102A1對(duì)脂肪酸的氧化活性，AHL氧化主要發(fā)生在酰基鏈的ω-1、ω-2和ω-3位的碳上，但與脂肪酸相比，酰基高絲氨酸及其內(nèi)酯是CYP102A1更好的底物[39]。Siri等[40]從姜根際中分離出了屬于不動(dòng)桿菌屬、伯克霍爾德氏菌屬和克雷伯氏菌屬的3種AHL滅活細(xì)菌，其中不動(dòng)桿菌和克雷伯氏菌菌株都表現(xiàn)出廣譜內(nèi)酯酶活性，但伯克霍爾德菌株將3-氧代-AHL還原為相應(yīng)的3-羥基化合物。這類AHL酶的研究還比較少，應(yīng)用方面的成果也不多。

3 群體感應(yīng)淬滅酶的應(yīng)用

3.1 群體感應(yīng)淬滅酶在植物病害防治方面的應(yīng)用

大部分植物致病菌能產(chǎn)生信號(hào)分子AHLs，通過群體感應(yīng)系統(tǒng)使植物產(chǎn)生病害。2004年，Toth等[41]將AHLs合成基因?qū)腭R鈴薯，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株，這些植株能夠產(chǎn)生AHLs，并增加了它們對(duì)歐文氏軟腐菌的敏感性。利用群體感應(yīng)淬滅防治植物病害已有研究，群體感應(yīng)淬滅可以在不殺死細(xì)菌的情況下，阻斷信號(hào)交流，影響致病因子的表達(dá)[42]，相較于傳統(tǒng)的農(nóng)藥噴灑方式，群體感應(yīng)淬滅是一種安全無毒且環(huán)境友好的防治策略。

在眾多植物病害中，軟腐病是最為常見的。番茄、馬鈴薯、黃瓜、白菜和胡蘿卜等蔬菜都深受其害，由于軟腐病會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)性病害，所以防治是相當(dāng)困難的。群體感應(yīng)淬滅可以在一定程度上提高這方面的防治效果。除了構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，從分子水平改造細(xì)菌，構(gòu)建生防菌株也是一種有效的防治植物病害的方式。從植物根際分離得到的熒光假單胞菌PseudomonasfluorescensP3，本身并不是抗植物病原體的有效生物控制劑，Molina等[43]將芽孢桿菌中的AHL內(nèi)酯酶基因aiiA基因在P.fluorescensP3中表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該工程菌獲得了降解AHLs的能力，并減少了馬鈴薯由歐文氏菌引起的胡蘿卜軟腐病和根癌土壤桿菌引起番茄冠癭病的概率。2000年，曾慧[44]將AHL內(nèi)酯酶aiiA基因?qū)氲胶行滦蛷V譜的氨基多元醇類抗生素雙效菌素(Zwittermicin,ZwA)的芽孢桿菌中，讓兩種具有不同抗病機(jī)制的物質(zhì)共同發(fā)揮作用，研究表明，aiiA基因的表達(dá)并不會(huì)影響ZwA的表達(dá)和產(chǎn)量，而且二者在抗病效果上具有協(xié)同作用。

3.2 群體感應(yīng)淬滅酶在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用

隨著水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，病害的發(fā)生頻率和種類不斷增加，每年給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的瓶頸之一。抗生素常被用作預(yù)防和治療水產(chǎn)養(yǎng)殖病害，然而，過度濫用抗生素治療細(xì)菌感染則導(dǎo)致多重耐藥菌株的出現(xiàn)，因此需要研究其他的方式替代抗生素來控制親水性細(xì)菌感染。

目前已證實(shí)致病菌的QS系統(tǒng)能調(diào)節(jié)不同水生病原體中毒力因子的產(chǎn)生[45]。Dong等[8]報(bào)道，芽孢桿菌240B1能夠酶促失活A(yù)HLs，隨后的研究表明，群體感應(yīng)淬滅酶可抑制水生有害菌毒力因子的表達(dá)。哈維氏弧菌是一種常見的水產(chǎn)品致病菌，Bai等[46]將AiiA蛋白在大腸桿菌BL21中過表達(dá)，重組大腸桿菌的裂解液不僅能抑制群體感應(yīng)報(bào)告菌株紫色桿菌ATCC 12472的色素合成，而且使哈維氏弧菌VIB391的生物發(fā)光強(qiáng)度減弱85%。

Song等[47]探究了短小芽孢桿菌F3-1對(duì)鯉魚存活率的影響，并在此基礎(chǔ)上，通過突變體育種的方式得到突變菌株短小芽孢桿菌FF1-2，研究其與原始菌株對(duì)鯉魚存活效果的不同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：短小芽孢桿菌F3-1及其突變菌株FF1-2在腹腔注射和浸泡試驗(yàn)中均具有保護(hù)鯉魚的效果，突變菌株在浸泡實(shí)驗(yàn)中顯示出更好的抗菌效果，同時(shí)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)突變體育種方式可以增加AHLs生物降解酶的產(chǎn)生。

雖然現(xiàn)有的研究表明,群體感應(yīng)淬滅酶可作為水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌疾病治療的有效方法，但抑制劑的安全性問題仍未明了，因?yàn)橐恍┤后w感應(yīng)破壞性化合物對(duì)水生動(dòng)物顯示出一些毒性。因此，對(duì)于群體感應(yīng)淬滅酶的應(yīng)用，安全性評(píng)估是必要的。

3.3 群體感應(yīng)淬滅酶在膜污染方面的應(yīng)用

生物膜是細(xì)菌的一種獨(dú)特生存方式，細(xì)菌會(huì)在水凈化系統(tǒng)的過濾膜上形成生物膜，極大地影響了濾膜表面的過濾性能，細(xì)菌生物膜形成是膜生物污損的主要原因[48]。物理和化學(xué)的防治手段容易使菌株產(chǎn)生抗性，而且成本高、污染大。研究表明，群體感應(yīng)通過AHLs類信號(hào)分子的交流調(diào)控生物膜形成，因此，阻斷細(xì)菌之間信號(hào)分子的交流成為了抑制生物膜形成的有效手段。2009年，Yeon等[49]首次將豬腎酰胺酶加入到用于污水深度處理的膜生物反應(yīng)器(MBR)中，發(fā)現(xiàn)酰胺酶能夠通過淬滅AHLs防止生物膜的產(chǎn)生，在此基礎(chǔ)上，該課題組又將酰胺酶負(fù)載到磁載體上再投放到MBR中，不但減少了酶的損失，而且還大大提升了作用效果[50]。

3.4 群體感應(yīng)淬滅酶在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

在抗生素盛行的今天，致病菌株逐漸出現(xiàn)耐藥性，各種“超級(jí)細(xì)菌”層出不窮，傳統(tǒng)的抗菌藥物已經(jīng)無法滿足臨床的需要。隨著人們不斷地分離鑒定QQ菌株以及對(duì)QQ功能的不斷探索，發(fā)現(xiàn)QQ在抗菌抗感染方面有著巨大的潛力，將會(huì)成為臨床抗菌藥物開發(fā)的一個(gè)創(chuàng)新方向[51]。

早在1965年，Tomasz[52]就發(fā)現(xiàn)在肺炎鏈球菌中分泌的多肽分子，能夠誘發(fā)相關(guān)蛋白的表達(dá)，這與我們現(xiàn)在所說的信號(hào)分子是非常相似的。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)是一種機(jī)會(huì)性病原體，可引起免疫功能低下的宿主急性感染和囊性纖維化患者的慢性疾病，QS調(diào)節(jié)其約5%的基因組的表達(dá)，包括許多與毒力相關(guān)的因素[53]。Rajesh等[50]將aiiA基因編碼的AHLs內(nèi)酯酶作用于銅綠假單胞菌，有效抑制了銅綠假單胞菌中生物膜的形成和綠膿菌素、鼠李糖脂、胞外多糖的產(chǎn)生。近年來，有人發(fā)現(xiàn)牙周病原體也通過群體感應(yīng)進(jìn)行溝通，牙菌斑是微生物生物膜的一個(gè)典型例子[54]。因此，牙齒疾病也可以采用群體感應(yīng)淬滅的方式進(jìn)行防治。

4 結(jié)論與展望

群體感應(yīng)淬滅能夠破壞細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，阻斷細(xì)菌的信息交流，在植物病害防治、水產(chǎn)養(yǎng)殖、膜污染以及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮了巨大的作用。AHL內(nèi)酯酶來源廣泛、酶學(xué)性質(zhì)明確，是主要的群體感應(yīng)淬滅酶，展現(xiàn)了較強(qiáng)的淬滅活性，是群體感應(yīng)淬滅的研究重點(diǎn)。但是，目前所了解的AHL內(nèi)酯酶的種類較單一，因此，以信息時(shí)代的大數(shù)據(jù)為依托，采用現(xiàn)代化計(jì)算機(jī)技術(shù)，篩選更多、更優(yōu)質(zhì)的群體感應(yīng)淬滅化合物具有十分重要的意義。環(huán)境中微生物的交流方式不止有QS這一種，因此，探究微生物之間復(fù)雜的交流機(jī)制及各種淬滅方式的協(xié)同作用，將會(huì)成為群體感應(yīng)淬滅研究的新趨勢(shì)。