乳酸菌群體感應及黏附性研究進展

史國萃，常 晶，李漸鵬，曾名湧，劉尊英

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類可以利用碳水化合物進行發酵并產生大量乳酸的細菌的通稱。乳酸菌是世界公認的對人類健康有益的安全級(generally recognized as safe，GRAS)菌株。乳酸菌在其生長過程中可以產生有機酸、細菌素和H2O2等抑菌性物質[1]，具有良好的抗菌活性和安全性，已成為一種新型的生物保鮮劑。水產品因其水分含量高、營養豐富，在貯藏及物流過程中極易腐敗變質。目前，乳酸菌在水產品保鮮上的應用已有成功報道[2]，但因水產品基質的特殊性，乳酸菌在水產品上的黏附和定殖仍存在巨大挑戰。本文中，筆者綜述了乳酸菌群體感應及黏附能力研究進展，以期為乳酸菌在水產品保鮮上的應用提供理論依據。

1 乳酸菌的群體感應

細菌的群體感應(quorum sensing,QS)是指細菌利用自誘導物進行相互交流并調控其群體行為的感應現象。細菌在生長過程中會分泌一種作為感知周圍環境的信號分子，同時通過感知信號分子濃度的變化來調控相關基因的表達，進而調控相關的行為性狀。自然界中大多數細菌都具有群體感應現象，革蘭氏陰性菌主要具有LuxI/LuxR系統，以N-酰基高絲氨酸內酯類(AHLs)物質作為信號分子，而革蘭氏陽性菌主要通過分泌自誘導肽類(AIPs)作為信號分子，這些自誘導肽分子量較小，必須借助于轉運蛋白或膜蛋白實現細胞內外的跨越，且具有一定的種屬特異性[3]。

1.1 乳酸菌QS系統

乳酸菌中的QS系統發現于1995年，Saucier等[4]發現當在乳酸桿菌中增加接種量或者直接加入其產生的細菌素carnobacteriocin時，可以恢復細菌素的產生。目前，乳酸菌所具有的群體感應系統為三組分系統，由自誘導肽、組氨酸激酶和感應調節蛋白三種成分組成，自誘導肽與組氨酸激酶的受體結合，激活其活性，組氨酸殘基發生自磷酸化，并將磷酸根轉移至感應調節蛋白受體中的天冬氨酸殘基，進而激活相應基因的表達[5]。乳酸菌中的主要抑菌物質為細菌素，其產生受到QS系統調控。細菌素主要分為兩類，其中Ⅰ型細菌素在產生后向外運輸的過程中會經過特殊的修飾與加工，而Ⅱ型細菌素不會經過加工修飾。因此，Ⅰ型細菌素本身可以作為一種AIP，Ⅱ型細菌素則需要一種多肽作為AIP，均由三組分系統調節。

1.2 乳酸菌QS信號分子

在種內交流中，乳酸菌以自誘導肽AIPs作為信號分子。AIPs具有體積小、高穩定性、高保守性的特點。AIP的合成包括核糖體合成前體肽，經過修飾加工后成為具有活性的AIPs，然后通過ATP功能結合模塊輸出[6]。不同細菌之間的AIPs具有一定的差異性，詳見表1。

表1 乳酸菌中信號分子肽的種類

細菌種內的群體感應可以保證菌體識別到自己種群的密度，依此來促進某些基因的表達，進而提高自身的競爭力，但是細菌一般都處于與其他細菌共存的環境中，不同細菌之間需要進行種間交流來達到最佳的共存效果。姜黎明等[12]研究發現，在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中均具有信號分子autoinducer-2(AI-2)，AI-2合成是以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，經過三步酶促反應生成S-核糖同型半胱氨酸(SRH)，在luxS基因編碼的SRH水解酶的催化作用下裂解成4,5-羥基-2,3-戊二酮(DPD)和高半胱氨酸，DPD發生自身環化后生成兩種同分異構體衍生物，這些衍生物之間都可以相互轉化，因此AI-2是一種混合物。在AI-2的合成過程中，luxS基因是催化AI-2合成的關鍵基因，在luxS突變體中不產生AI-2[13]。在不同的細菌中，DPD的結構一般是相同的，但是AI-2的受體不同。在哈維氏弧菌中，AI-2的受體蛋白為LuxP，再與組氨酸蛋白激酶LuxQ相互作用，可以調控相關基因的表達，但是在乳酸菌中的受體蛋白尚不明確。

2 乳酸菌的黏附因素

乳酸菌在機體表面的黏附是乳酸菌起益生作用的第一步，對于益生菌而言，黏附并迅速增殖是其抑菌的關鍵步驟。黏附初期，細菌能否附著在細胞表面是由其表面的理化性質決定的，主要由表層蛋白性質決定。黏附后期，當菌體不斷增殖，細菌會逐漸形成大量的微菌落，微菌落大量聚集，最終形成生物膜。近年來的研究發現QS系統可以調節乳酸菌的黏附能力。

2.1 表層蛋白的影響

細菌的初始黏附和生物膜的形成是由不同的基因控制的，細菌的黏附是生物膜形成的重要前提[14]。乳酸菌生物膜形成過程見圖1。乳酸菌的黏附主要與其表面的黏附因子和黏附受體有關，在細菌的細胞壁表面存在透明、勻稱的晶格陣列結構，這層結構可以溶解為蛋白單體，即表層蛋白，這層蛋白具有細胞黏附的功能[15]。一般乳酸菌表層蛋白的分子量較小，其等電點為9.4～10.4，與其他表層蛋白不同。

圖1 乳酸菌生物膜形成過程 Fig.1 Biofilm formation process of lactic acid bacteria

表層蛋白具有亞基成分單一，孔隙大小以及形態相似等特點，在生物學、納米技術等方面具有重大的應用價值。Ramiah等[16]研究表明，黏液靶向黏附素MUB，作為一種目前研究相對較為清晰的表層蛋白，具有重復的功能性結構域和典型的蛋白黏附特性。Ramiah等[17]研究表明將植物乳桿菌中的表層蛋白去除后，其對Caco-2細胞的黏附能力降低40%。Kos等[18]將嗜酸乳桿菌M92中的表層蛋白移除后，其對腸上皮細胞的黏附能力和自聚集性均降低。從瑞士乳桿菌中提取出表層蛋白，并且將表層蛋白對腸道細胞進行前處理可以將大腸桿菌的黏附性和致病性大大降低，表明乳酸菌的表層蛋白可以阻斷腸道致病菌的感染[19]。

目前，檢測乳酸菌黏附能力有多種方法，可通過乳酸菌與細胞之間的體內黏附直接檢測，也可以通過測定乳酸菌表面的理化特性進行間接檢測，如疏水性或自聚合力可以間接反映其黏附性的強弱，細胞表面的疏水性越高，黏附能力越強。如Carasi等[20]通過體外黏附和疏水性實驗共同評價了Lactobacilluskefiri對小腸的黏附能力。

He等[21]研究了24株雙歧桿菌對于糖蛋白的結合能力，發現乳酸菌的黏附具有宿主特異性，該雙歧桿菌在人腸黏液中的黏附能力優于牛腸黏液中的黏附能力，此菌的黏附特性表現出應變依賴性。有一些乳酸菌中的表層蛋白會因為環境中的離子強度的不同導致表層蛋白疏水性的改變，因此對宿主細胞會具有不同的結合能力。而嗜酸乳桿菌ATCC4356在不同的離子強度下會產生不同的疏水性，在高離子強度下，分子內靜電斥力降低，表層蛋白出現，表現出更強的親水性[22]。對于不同的菌株對同一宿主的黏附能力也不同，Argyri等[23]從天然發酵橄欖中分離出明串珠菌、植物乳桿菌等多種不同乳酸菌，并且發現這些菌株對于Caco-2細胞的黏附率差異顯著。

表層蛋白基因對于闡明表層蛋白的生物膜轉移機制等方面有著重要的意義，對于表層蛋白的基因學研究也比較廣泛。在多種乳桿菌中均存在著表層蛋白基因(slp)，從短乳桿菌ATCC14869中分離出slpB、slpC和slpD3種基因，并且在不同的生長條件下可以形成平滑和粗糙這兩種菌落類型[24]。而且在高鹽的條件下，嗜酸乳桿菌ATCC4356中的表層蛋白的數量受到很大的影響，相關基因的表達有所增加，由于表層蛋白的增加和釋放會導致其抗菌能力的提升[25]，在不同濃度粘蛋白的作用下，slp基因的表達量似乎沒有影響，然而在膽汁和胰酶的作用下，基因的表達量上調近30倍[26]。

表層蛋白具有很強的水解活性，可以作為自誘導肽的來源，在糞腸球菌和鏈球菌中發現表層蛋白水解后會形成信號肽，它們分泌的物質中含有疏水性氨基酸，可以被裂解為信號分子[27]。

2.2 生物膜的影響

生物膜是細菌菌體為抵御不良環境而形成的一種具有高度組織化的微群落聚集體。有關生物膜最早的研究是致病菌中牙菌斑與齲齒[28]的關系，致病菌的致病性與生物膜的產生有關。

乳酸菌的生物膜的形成可以大大提高菌體的抗逆能力，相比于游離的菌落，生物膜表層細菌的生理活性已經發生了改變。生物膜表層的細菌會將更多的有機基質分泌到胞外，這種黏性物質在細菌生長中具有屏障作用，使得菌體的黏附能力有所提高，并且對環境的抵抗能力增強。生物膜表層乳酸菌比游離乳酸菌對乙酸和乙醇的耐受性更強，對生物膜表層乳酸菌的損傷要遠遠小于游離乳酸菌，因此生物膜對于細菌具有一定保護作用[29]。

實際上，細菌生物膜的形成是一個動態的過程，生物膜的形成主要經歷調節膜的形成、菌體黏附、生物膜的發展、生物膜的成熟和細菌播散5個過程[30]。其中，宿主表面的糖蛋白、脂質等成分可以通過沉積、范德華力和靜電引力[31]等作用短暫可逆的附著于宿主表面，形成不成熟的生物膜，是乳酸菌生物膜達到成熟的前體。同時，在生物膜的形成過程中基因表型會發生變化，不同階段的基因表達量不同。Nett等[32]研究發現，與生物膜形成有關的基因ALS1在生物膜形成的不同階段其表達量是不同的。乳酸菌作為一種益生菌，能夠快速黏附到腸道或基質表面是其發揮益生作用的前提。

3 乳酸菌QS系統與乳酸菌黏附性的關系

乳酸菌的黏附能力與其產生的表面多糖、細胞膜蛋白等物質有關。在植物乳桿菌WCFS1中發現，乳酸菌與金黃色葡萄球菌具有相似的QS系統lamBDCA，lamA突變株對玻璃表面的黏附性低于野生型菌株，這是首次發現非致病菌類agr系統編碼自誘導肽并且參與調節黏附[7]。同時AI-2介導QS可以調控乳酸菌的黏附能力，L.acidophilus的luxS突變株對于Caco-2的黏附與野生型相比下降58%，因此推斷QS系統可能會調節乳酸菌的黏附能力[33]。

細菌生物膜的成分與黏附之間具有正相關性，而且群體感應系統對生物膜的形成通過不同的途徑發揮著調控作用，有關群體感應與生物膜的形成之間的關系有著較為廣泛的研究。首先，在植物乳桿菌HE-1中生物膜的數量和AI-2信號分子數量之間呈正相關，由此推斷出生物膜的形成與AI-2系統具有密切的關系[34]。Laganenka等[35]研究表明糞腸球菌產生的AI-2可以提高大腸桿菌的群體感應，這種混合的雙物種生物膜的形成可以提高大腸桿菌和糞腸球菌的抗逆性。劉蕾等[36]對植物乳桿菌L-ZS9生物膜細胞的黏附能力進行了研究，發現形成生物膜的細菌的黏附率比浮游細菌高1.5倍，并且0.5%的AI-2對生物膜的形成具有最強的有益作用，并且已經形成生物膜的菌體比浮游細菌具有更強的抗逆性。同樣，Kubota等[29]的研究表明，腐敗乳酸菌一旦形成生物膜，即使在稀釋后，其對醋酸的抗性也要高于游離菌體。然而，乳酸菌的生物膜形成受許多因素影響。Liu等[37]研究發現，D-核糖可以作為群體感應抑制劑通過調控糖酵解途徑、細胞外DNA降解、轉錄和翻譯等多種基因來抑制乳酸菌生物膜的形成。在模擬胃腸道的環境下，膽汁的濃度會影響到乳酸菌生物膜的形成[38]。表面多糖中的半乳糖分子可以增加植物乳桿菌的黏附能力和生物膜的形成能力[39]。在副溶血弧菌中，NaCl也可以通過影響AI-2的產量來控制生物膜的形成[40]。

有關QS系統與乳酸菌生物膜之間的關系，目前研究較為清晰的是植物乳桿菌WCFS1。根據此菌的全基因組序列中的基因位點，發現該菌的基因與葡萄球菌的agr系統具有同源性，組氨酸激酶AgrC和反應調節子AgrA組成雙組分調節系統，AgrD作為自誘導肽的前體物質，在AgrB作用下得到加工和修飾，并運輸到膜外，與胞外的AgrC結合，將反應調節子AgrA激活。Lam系統參與了植物乳桿菌表面黏附與生物膜形成的調節，說明乳酸菌的QS系統、生物膜的形成、黏附能力三者密切相關[7]。

QS系統對生物膜的作用主要體現在發展期和散播期。在細菌發展期，在生長繁殖的同時分泌了大量的胞外基質，這一階段乳酸菌可以進行黏附聚集，產生更多的信號分子促進生物膜的成熟。生物膜成熟后，會導致大量的代謝廢物聚集，在這一過程中菌體會通過特定基因的表達使得部分細菌脫落，避免了細菌出現營養匱乏的現象[41]。因此利用QS系統提高乳酸菌的初期黏附能力，進而增強有益菌的生物膜的形成益生作用具有重要的意義。

4 乳酸菌在水產品保鮮中的應用

水產品在加工和儲存過程中，其所處的低溫和厭氧環境有利于嗜冷菌的生長。水產品中微生物的數量和組成取決于多種因素，原材料的質量、加工用的工具、采用的生產方法均會對產品中的微生物組成有影響。因此，對于水產品的保鮮，僅僅依靠低溫條件或低溫技術有著嚴格的局限性，因此低成本的微生物保鮮具有廣闊的發展前景。乳酸菌可以耐受低pH，可以在其他細菌無法生長的環境下進行生長，從而可以保持食品的安全，利用乳酸菌及其產生的抗菌物質進行生物保藏的應用已引起廣泛關注。

一般，在冷藏條件下，新鮮的水產品中主要的有害微生物是弧菌屬、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等，主要的腐敗菌是希瓦氏菌和假單胞菌屬。乳酸菌產生抗菌性的代謝產物，可以阻止腐敗菌的生長，防止食品的腐敗變質。乳酸菌可以顯著的抑制多種菌的生長，且主要的抑菌物質為細菌素。乳酸菌細菌素可影響細菌細胞膜、DNA和蛋白質的合成從而達到抑菌效果。Amin等[42]從大西洋鮭魚腸道中分離出來20株乳酸菌，并且發現這些菌中有3株菌至少可以對2種病原菌產生抑制作用，且抑菌物質主要為細菌素。Gmez-Sala等[43]從海產品中篩選出1 245株乳酸菌，其中有197株對20種腐敗菌和病原菌產生抑制作用，起關鍵作用的抑菌物質也是細菌素。張艷[44]從小米椒和牛腸黏膜上分離出具有廣譜抑菌效果的乳酸菌，并利用克隆技術將3個高產乳酸菌素的相關基因sppK、JSA、JSB進行克隆，其工程菌株可以產生更多的細菌素。

目前，單一保鮮措施對水產品的保鮮都存在局限性，因此保鮮措施聯合使用或柵欄技術可更好地保持水產品品質。乳酸菌與其他保鮮劑聯用可以達到更好的保鮮效果。例如，Altieri等[45]將雙歧桿菌和百里酚聯合保鮮魚片，結果顯示兩者聯合對魚片的保鮮作用顯著增加。Todorov等[46]將乳酸菌素分別與萬古霉素、蜂膠和EDTA聯合使用可以更好地抑制單增李斯特菌生物膜的形成，其中效果最好的是萬古霉素與乳酸菌素協同作用。

生物胺是評價水產品腐敗的指標，可以在一定程度上預測水產品腐敗的程度，而一些乳酸菌可以產生生物胺氧化酶，可以有效降低微環境中的生物胺含量。[47]研究表明，與對照相比，在泡菜中添加植物乳桿菌組中酪胺、尸胺和腐胺的含量顯著降低。Hu等[48]研究發現，通過植物乳桿菌、木糖葡萄球菌和戊糖片球菌的聯合作用，可以有效地抑制發酵鯉魚香腸中生物胺的積累，這表明，優化乳酸菌生長條件，將其應用于水產品保鮮并降低水產品生物胺含量具有可行性。

乳酸菌的生物膜主要對水產品加工過程中致病菌防治具有重要的作用。乳酸菌可以黏附在食品表面，通過空間位阻來阻止其他病原菌的定植。Elisa等[49]研究表明只有生物膜狀態的糞腸球菌對假單胞菌具有抑制作用，Speranza等[50]通過對奶酪發酵過程中單增李斯特菌的檢測也發現，乳酸菌形成的生物膜可以有效的延緩李斯特菌的生長。因此，研究乳酸菌在水產品上的生物膜形成與黏附能力，對開發乳酸菌生物保鮮技術非常重要。

5 展望

乳酸菌作為一種生物保鮮劑具有獨特的優勢和特點，在延長水產品保質期方面發揮著重要的作用。乳酸菌發揮益生作用的第一步是黏附，目前對于乳酸菌的黏附研究主要集中于腸道，對于乳酸菌在食品基質中的黏附過程研究較少。因此，未來工作中，研究乳酸菌的黏附過程及其機制非常重要。此外，通過群體感應系統提高乳酸菌黏附能力，或通過添加外源物質提高其黏附能力，或者篩選出具有較高黏附能力的菌株對及加速乳酸菌的工業化應用都將產生重大的影響。