酵母菌對乳酸菌發酵特性及信號分子AI-2活性的影響

顧 悅，田建軍，劉敏敏，李 博，張 悅，賀銀鳳

(內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018)

食品的發酵過程通常由多種微生物共同協作完成，微生物之間的相互作用決定了不同菌株的生產性能，最終影響發酵產品的風味、質地等特性。乳酸菌和酵母菌的共培養被廣泛地應用在發酵飲料及食品的生產中[1-3]，二者的共培養對發酵產品的風味特點、感官特性甚至發酵效率等方面都存在顯著的促進作用[4-6]。除此之外，乳酸菌和酵母菌的混合培養同樣有利于控制發酵食品中有害物質的含量以及降低致病菌的毒害作用。相比于乳酸菌的單菌發酵，混合培養還可以顯著提高發酵產品的抗氧化特性[7]以及降低霉菌毒素的含量[8]。

群體感應(quorum sensing,QS)系統是細菌菌體間相互交流的重要機制，對細菌特定生理功能和基因的表達具有一定的調控作用[9]。其中，LuxS/AI-2 QS系統以自體誘導物-2(autoinducer 2,AI-2)作為信號分子介導種間信息的交流[10]。乳酸菌作為食品發酵過程中的主要微生物，其多種生理功能均受到LuxS/AI-2 QS系統的調控，例如生物膜的形成[11]、對宿主腸道細胞的黏附以及降低致病菌對宿主細胞的侵襲[12]等。

隨著對LuxS/AI-2 QS系統研究的不斷深入，發現QS系統在細菌共培養的過程中也發揮著重要的作用。不同乳酸菌菌株共培養時LuxS蛋白的表達水平發生顯著改變[13]，同時，乳酸菌還可以影響其他共培養菌株的信號分子AI-2的分泌[14]。但是，酵母菌作為與乳酸菌具有復雜互作關系的微生物之一，其對乳酸菌信號分子AI-2活性及LuxS/AI-2 QS系統影響的研究還相對較少。

本實驗中，筆者以酸馬奶酒中分離得到的一組乳酸菌和酵母菌組合為研究對象，探究酵母菌對乳酸菌生長的影響，同時分析共培養對乳酸菌發酵特性以及信號分子AI-2活性產生的影響，以期為深入研究乳酸菌和酵母菌混合發酵時LuxS/AI-2 QS系統的調控作用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基和試劑

Enterococcusfaecium8-3、SaccharomycescerevisiaeJ8，由內蒙古農業大學“內蒙古傳統發酵乳制品中乳酸菌和酵母菌共生機理的研究”課題組提供；VibrioharveyiBB170，美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC)(BAA-1117)。

脫脂乳培養基、MRS培養基、YEPD培養基、AB培養基根據文獻[15-18]配制。實驗中所用試劑均為市售國產分析純。

1.2 儀器與設備

BCN-1360型生物超凈工作臺，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；HSP-250型生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；高速冷凍離心機，美國Eppendorf公司；Scientific Multiskan FC酶標儀，美國Thermo公司；Perkin Elmer victor X 酶標儀酶標儀，美國Perkin Elmer公司；GC-9A型氣相色譜儀、20-AT型高效液相色譜儀，日本島津公司；820型熒光分光光度計，日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 無細胞發酵上清液(CFS)的制備

將S.cerevisiaeJ8在YEPD培養基中活化2代，按2%(體積分數)接種3代，30 ℃振蕩培養70 h，收集發酵液，4 000 r/min離心20 min。收集上清液并調pH至6.5±0.2，再經0.45 μm濾菌器過濾除菌，得到酵母菌無細胞發酵上清液(CFS)作為酵母菌代謝產物，于-80 ℃保存。

1.3.2 酵母菌對乳酸菌生長的影響

將E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8分別在MRS培養基和YEPD培養基中活化2代，活化后的E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8以體積比9∶ 1進行混合，按2%接種量接入脫脂乳培養基，30 ℃振蕩培養12 h，然后37 ℃靜置培養24 h作為共培養實驗組，E.faecium8-3單菌培養作為對照組。0～36 h的培養過程中，每4 h測定E.faecium8-3活菌數，以每毫升發酵液中的菌落數來計算。

1.3.3 酵母菌對乳酸菌發酵特性的影響

1)酵母菌對乳酸菌產游離氨基氮的影響。將E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8共培養，0～36 h內，每4 h收集實驗組和對照組的發酵液，采用鄰苯二甲醛衍生比色法[19]測定游離氨基氮(FAN)的含量。

2)酵母菌對乳酸菌產揮發性有機酸含量的影響。使用氣相色譜法分別測定共培養實驗組和對照組中乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和異戊酸的含量。氣相色譜條件：色譜柱為柱長2 m、內徑3 mm的不銹鋼柱，固定相為15%的鄰苯二甲酸二壬酯與5%的吐溫-80混合固定液，擔體為Chromosorb HP(80-100 mesh)，溫度為柱溫100 ℃、檢測器及汽化室溫度為150 ℃，氣體流速為載氣(N2)30 mL/min、H250 mL/min、空氣500 mL/min，靈敏度為102，進樣量為1 μL， 紙速為2 mm/min[20]。

3)酵母菌對乳酸菌產不揮發性有機酸的影響。使用高效液相色譜法分別測定實驗組和對照組中蘋果酸、酒石酸及檸檬酸的含量。高效液相色譜條件：色譜柱為C18柱、4.6 mm×150 mm，流動相為0.01 mol/L (NH4)2HPO4，用1 mol/L磷酸調pH至2.7，臨用前使用超聲波脫氣，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL。使用高效液相色譜法進行分離，于210 nm處進行紫外檢測，用峰面積標準曲線對有機酸的含量進行計算[21]。

4)酵母菌對乙醛含量的影響。將實驗組和對照組中待測樣品與等體積16%三氯乙酸(TCA)溶液進行混合，3 500 r/min離心10 min，收集上清液備用。將5 mL NaHSO3(10 g/L)與25 mL待測上清液進行混合，室溫靜置1 h后，加入10 g/L的淀粉溶液1 mL，使用0.1 mol/L碘液滴至接近終點，再用0.01 mol/L的碘液滴至終點。再加入20 mL 1.0 mol/L的NaHSO3，振蕩混勻，用0.01 mol/L碘標準溶液滴定至終點，消耗標準碘液體積記為V1，空白實驗消耗碘液體積記為V2[22]。乙醛含量的計算：乙醛含量=(V1-V2)×標準溶液的濃度×0.22/25。

5)酵母菌對乳酸菌產丁二酮的影響。將實驗組和對照組中待測樣品與等體積16%TCA溶液進行混合，3 500 r/min離心10 min，收集上清液備用。分別取處理后的上清液10 mL與0.5 mL和0 mL的1%鄰苯二胺溶液進行充分混合，黑暗處靜置30 min后，分別加入2 mL和2.5 mL 4 mol/L 的HCl溶液，混合均勻。以添加0 mL 1%鄰苯二胺的溶液作為參比液，于335 nm處測定吸光度值。將丁二酮濃度作為橫坐標，吸光度值作為縱坐標繪制標準曲線[22]。

6)酵母菌對乳酸菌產維生素的影響。采用熒光法測定實驗組和對照組中維生素的含量。其中，維生素A(VA)和維生素E(VE)參照文獻[23]、維生素B1(VB1)參照文獻[24]、維生素B2(VB2)參照文獻[25]測定，以每100 g發酵液中維生素的含量計算。

1.3.4 酵母菌對乳酸菌信號分子AI-2活性的影響

將E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8進行共培養，共培養組作為實驗組，E.faecium8-3單菌培養作為對照組。在4～37 h的培養過程中，每隔3 h取發酵液制備CFS。利用V.harveyiBB170的生物學方法對實驗組CFS、對照組CFS以及S.cerevisiaeJ8 CFS中信號分子AI-2的活性進行測定[26]。

2 結果與討論

2.1 酵母菌對乳酸菌菌株生長的影響結果

S.cerevisiaeJ8對E.faecium8-3活菌數的影響結果見圖1。

由圖1可知：當E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8菌體共培養時，0～12 h時，對照組的活菌數高于實驗組，這可能是因為此時振蕩培養更有利于S.cerevisiaeJ8的生長。16～40 h時，實驗組的活菌數高于對照組，因此，S.cerevisiaeJ8對E.faecium8-3的生長具有一定的促進作用。

圖1 釀酒酵母J8對屎腸球菌8-3活菌數的影響 Fig.1 Effects of S. cerevisiae J8 on viable counts of E .faecium 8-3

2.2 酵母菌對乳酸菌發酵特性的影響結果

2.2.1 酵母菌對乳酸菌產游離氨基氮的影響結果

E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8共培養對發酵液中游離氨基氮含量的影響結果如圖2所示。游離氨基氮主要是由蛋白質降解形成的氨基酸和小分子量的短肽組成。

*表示差異顯著,P<0.05圖2 釀酒酵母J8對游離氨基氮濃度的影響 Fig.2 Effects of S. cerevisiae J8 on free amino nitrogen content

由圖2可知：與E.faecium8-3單菌培養相比，S.cerevisiaeJ8的添加對發酵液游離氨基氮的含量產生一定影響。在0～36 h的培養過程中，E.faecium8-3單菌培養的發酵液中游離氨基氮的含量在0～4 h時呈下降趨勢，之后呈上升趨勢且在20 h時達到10.8 mmol/L。添加S.cerevisiaeJ8后，發酵液中游離氨基氮的含量在0～12 h呈上升趨勢且在12 h達到12.1 mmol/L。同時，在4、12和16 h時，共培養菌株的發酵液中游離氨基氮的含量顯著高于E.faecium8-3單菌培養時的含量。以上結果說明，E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8共培養可以提高發酵液中游離氨基氮的最高含量并縮短最高游離氨基氮的產生時間。

2.2.2 酵母菌對揮發性有機酸含量的影響結果

發酵乳制品中有機酸主要是通過乳酸菌代謝產生，E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8共培養對發酵液中揮發性有機酸含量的影響結果如圖3所示。

由圖3可知：發酵液中測定的揮發性有機酸有乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和異戊酸，在12～36 h的培養過程中，實驗組和對照組中乳酸的含量均呈上升趨勢，在12 h時，S.cerevisiaeJ8明顯降低了發酵液中乳酸的含量，但在24 h和36 h時無明顯影響。同時，在36 h時，實驗組中乳酸為15.302 g/L，對照組中乳酸為15.126 g/L。結果說明，當環境中存在S.cerevisiaeJ8時會降低發酵液中乳酸產生的速率，但對乳酸的最高生成量無影響。

實驗組中甲酸質量濃度呈先上升后下降的趨勢并在24 h達到1.503 mg/L，而對照組中甲酸含量一直呈上升趨勢并在36 h到達1.681 mg/L。在36 h時，實驗組中甲酸的量急劇下降(0.230 mg/L)，比對照組有明顯的降低。與乳酸和甲酸相比，在12～36 h的培養過程中，實驗組和對照組中乙酸含量的變化相對較小，S.cerevisiaeJ8的添加沒有改變乙酸含量的變化規律。

在12～24 h的培養過程中，實驗組中丙酸的含量高于對照組，當培養時間達到36 h時，實驗組和對照組中丙酸的含量無明顯差異，說明S.cerevisiaeJ8的添加會提高丙酸的生成速率，但對其最高生成量無影響。在實驗組和對照組中，丁酸含量的變化基本保持一致，在12～36 h時基本保持穩定，36 h時實驗組中丁酸為0.118 mg/L，而對照組中為0.120 mg/L，說明S.cerevisiaeJ8對E.faecium8-3發酵產丁酸無明顯影響。

在12 h和36 h時，實驗組中戊酸含量比對照組相對較低，在24 h時，實驗組中戊酸的含量比對照組相對較高，且實驗組組戊酸質量濃度在24 h達到0.351 mg/L，對照組在36 h時戊酸質量濃度達到0.411 mg/L。實驗組中異戊酸的質量濃度在12 h時基本達到最高值并在12～36 h的培養過程中基本保持穩定，且其最大生成量為0.546 mg/L，而對照組中異戊酸的含量隨培養時間的延長呈上升趨勢并在36 h達到最大值(0.588 mg/L)，結果說明S.cerevisiaeJ8可以提高E.faecium8-3發酵產異戊酸的速率。

圖3 釀酒酵母J8對揮發性有機酸產量的影響 Fig.3 Effects of S. cerevisiae J8 on volatile organic acids content

因此，通過比較實驗組和對照組中揮發性有機酸含量的變化可知：S.cerevisiaeJ8會降低E.faecium8-3產乳酸的速率，但對其乳酸最大生成量無明顯影響，同時，可明顯降低36 h時甲酸和戊酸的含量；S.cerevisiaeJ8可以提高E.faecium8-3發酵產丙酸和異戊酸的速率，但是，對乙酸和丁酸含量的變化無明顯的作用。

2.2.3 酵母菌對不揮發性有機酸含量的影響結果

E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8共培養對發酵液中不揮發性有機酸含量的影響結果如圖4所示。

由圖4可知：發酵液中測定的不揮發性有機酸有蘋果酸、酒石酸和檸檬酸。在0～12 h的培養過程中，實驗組中3種不揮發性有機酸的形成速率比對照組有所降低，這可能是由于在0～12 h時的培養環境更有利于S.cerevisiaeJ8的生長代謝，而不利于E.faecium8-3的生長，所以3種酸的生成速率有所下降。在12～36 h的培養過程中，實驗組中3種不揮發性有機酸的含量均隨培養時間的延長呈上升的趨勢，而對照組中有機酸的含量隨培養時間的延長呈下降趨勢，在36 h時，實驗組中3種不揮發性有機酸的含量均高于對照組。同時，由對照組中3種酸含量的變化趨勢可知，E.faecium8-3在培養代謝的過程中可能會轉化部分酸，使得3種酸含量降低。

圖4 釀酒酵母J8對不揮發性有機酸含量的影響 Fig.4 Effects of S. cerevisiae J8 on nonvolatile organic acids content

通過比較實驗組和對照組中不揮發性有機酸含量的變化可知，S.cerevisiaeJ8會降低E.faecium8-3在0～12 h時不揮發性的生成速率，但是卻可以提高36 h時3種酸的最大生成量，對蘋果酸、酒石酸和檸檬酸的形成有促進作用。

2.2.4 酵母菌對乙醛和丁二酮含量的影響

在乳制品的發酵過程中，乳酸菌分解基質物質，除形成乳酸、乙酸等有機酸類風味物質外，還可以通過代謝產生乙醛、丁二酮和3-羥基丁酮等物質，而這些都是酸乳的風味物質。E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8共培養對發酵液中乙醛和丁二酮含量的影響，結果如圖5所示。

由圖5可知：實驗組和對照組中乙醛和丁二酮的含量均隨培養時間的延長而不斷增加，但二者的變化規律略有差異。

*表示差異顯著，P<0.05圖5 釀酒酵母J8對乙醛和丁二酮質量濃度的影響 Fig.5 Effects of S. cerevisiae J8 on acetaldehyde and butanedione content

在12 h時，實驗組中乙醛的含量明顯低于對照組，這可能是因為此時的培養條件更適宜S.cerevisiaeJ8生長，因此，培養環境影響了E.faecium8-3的生長和代謝。但隨著培養時間的延長，實驗組中乙醛含量迅速增加且均顯著高于對照組，在36 h時，實驗組和對照組中的乙醛分別可達32.56和24.64 mg/mL，說明當E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8共培養時可以促進E.faecium8-3代謝產乙醛。

在12～36 h的培養過程中，實驗組和對照組中丁二酮的含量差異不顯著，因此，當E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8共培養時對E.faecium8-3代謝產丁二酮無顯著影響。這可能是因為丁二酮主要通過乳酸菌的檸檬酸代謝途徑產生[27]，而脫脂乳中檸檬酸的含量相對較少，因此對E.faecium8-3單菌培養、與S.cerevisiaeJ8共培養產丁二酮的影響較小。

2.2.5 酵母菌對維生素含量的影響結果

在36 h時，E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8共培養對發酵液中維生素含量的影響，結果如圖6所示。

由圖6可知：發酵液中測定的維生素有脂溶性維素VA和VE以及水溶性維生素VB1和VB2。實驗組中4種維生素的含量均低于對照組，說明S.cerevisiaeJ8和E.faecium8-3共培養會降低發酵乳中VA、VE、VB1和VB2的含量，這可能是因為在乳酸菌和酵母菌共培養的過程中存在代謝產物的相互利用及降解作用。

圖6 釀酒酵母J8對維生素含量的影響 Fig.6 Effects of S. cerevisiae J8 on vitamin content

2.3 酵母菌對信號分子AI-2活性的影響結果

2.3.1 酵母菌代謝產物信號分子AI-2活性檢測

檢測S.cerevisiaeJ8 CFS的相對熒光強度，結果如表1所示。

由表1可知：S.cerevisiaeJ8 CFS的相對熒光強度與介質對照的相對熒光強度無顯著差異，說明S.cerevisiaeJ8的代謝產物中不含有信號分子AI-2。因此，排除了酵母菌可能分泌信號分子AI-2對E.faecium8-3造成的影響。

表1 釀酒酵母J8 CFS的相對熒光強度

2.3.2 酵母菌對信號分子AI-2活性的影響

E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8共培養對乳酸菌信號分子AI-2活性的影響，結果如圖7所示。

由圖7可知：當E.faecium8-3與S.cerevisiaeJ8共培養時，除34 h外，其余培養時間E.faecium8-3信號分子AI-2的活性均有所下降，且呈現顯著或極顯著的抑制作用，這可能是由于S.cerevisiaeJ8大量繁殖，培養基中營養物質消耗迅速，使得E.faecium8-3分泌信號分子AI-2的能力下降。此結果說明，當S.cerevisiaeJ8與E.faecium8-3共培養時會抑制其信號分子AI-2的分泌。

*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01圖7 釀酒酵母J8對屎腸球菌8-3信號分子 AI-2活性的影響 Fig.7 Effects of S. cerevisiae J8 on AI-2 activity of E. faecium 8-3

2.4 討論

2.4.1 乳酸菌和酵母菌共培養對發酵產物的影響

乳酸菌和酵母菌在共培養的過程中形成了穩定的互作關系，二者的共培養對發酵產品中多種物質的含量都產生了一定的影響。氨基酸態氮的含量可以作為評判發酵程度的指標之一，實驗中S.cerevisiaeJ8可以提高發酵液中游離氨基氮的最高含量并縮短最高游離氨基氮的產生時間，這可能是因為二者共培養后乳酸菌可以分泌更多的蛋白酶，這些酶類物質可以將蛋白質水解為氨基酸和肽類，進而增加了游離氨基氮的含量[28]。有機酸的含量會影響產品的酸性口感，乳酸菌可以通過戊糖磷酸途徑產生乳酸和乙酸，S.cerevisiaeJ8會降低E.faecium8-3產乳酸的速率和甲酸、戊酸的含量，但可以提高丙酸和異戊酸的生成速率，對乙酸和丁酸含量的變化無明顯的作用，這可能是由于S.cerevisiaeJ8對不同有機酸的利用存在差異。利用高效液相色法對發酵乳中有機酸的含量進行測定，結果顯示，乳酸含量顯著高于乙酸、檸檬酸等，這也與田輝等[29]結果相同。龍興瑤等[28]對藏靈菇牦牛酸乳發酵過程中的有機酸含量進行測定，結果發現，乙酸和檸檬酸的含量均隨發酵時間的延長而減少，這是因為檸檬酸是許多風味物質的前體物，在酸乳發酵后期檸檬酸可以轉化成其他風味物質，導致檸檬酸的含量下降[30]。但在本實驗中，乙酸和檸檬酸的含量隨發酵時間的延長均未下降，這可能是由于酵母菌促進了乳酸菌有機酸的形成，使其形成與風味物質的轉化保持同步水平。

乳酸菌利用蘇氨酸可以生成乙醛，是酸奶制品形成特殊風味的主要物質，由于乳酸菌水解脂肪酸和蛋白質的能力有限，因而，大部分的必需氨基酸都是從牛乳中獲取[31-32]。酵母菌分解基質物質能夠分泌蘇氨酸，因此，當乳酸菌和酵母菌共培養時可能會提高乙醛的生成量[33]，這也與本實驗的結果相一致，Gadaga等[34]的研究也有類似的結果。維生素是許多活性酶類的輔酶，可以調節多種物質的代謝過程。S.cerevisiaeJ8和E.faecium8-3共培養會降低發酵乳中VA、VE、VB1和VB2的含量，這可能是由于酵母菌的多種生理代謝均與維生素有關，進而影響了維生素的含量。

2.4.2 酵母菌對乳酸菌信號分子AI-2活性的影響

早期對乳酸菌和酵母菌互作機制的研究主要是在營養方面，二者可以利用彼此的代謝產物影響自身的生長及代謝。隨著QS的發現，環境中乳酸菌分泌的信號分子是否會影響菌株間的交流還不得而知。E.faecium8-3和S.cerevisiaeJ8共培養時，其信號分子AI-2的活性會受到顯著抑制，這可能是由于酵母菌與乳酸菌共培養改變了培養環境中的pH、營養條件等，不同的培養環境會對乳酸菌信號分子AI-2的活性產生影響[35]。廉雪花[36]在對乳酸菌和酵母菌共培養過程中信號分子AI-2活性進行研究時發現，克魯克酵母 J6、厚壁孢酵母 J23-1、有孢圓酵母 J11的代謝產物在一定培養時間內也對E.faecium8-3信號分子AI-2的產生有促進作用。燕彩玲[37]的研究結果顯示，不同乳酸菌和酵母菌組合對信號分子AI-2活性的影響具有一定的差異性。

3 結論

S.cerevisiaeJ8可以促進E.faecium8-3的生長，同時，二者共培養可以提高發酵乳中游離氨基氮、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸和乙醛的含量，并提高乳酸、丙酸和異戊酸的生成速率，降低甲酸、戊酸和維生素的含量，但對乙酸、丁酸和丁二醛的影響較小。同時，S.cerevisiaeJ8對信號分子AI-2的活性會產生一定影響，S.cerevisiaeJ8和E.faecium8-3共培養極顯著抑制信號分子AI-2的分泌，因此，S.cerevisiaeJ8和E.faecium8-3共培養會影響乳酸菌的LuxS/AI-2群體感應系統。