群體感應調控干腌肉制品中乳酸菌環境脅迫應激機制研究進展

張 琦，儲雨姍，顧賽麒，徐 霞，丁玉庭，周緒霞

(浙江工業大學食品工程與質量控制研究所，浙江杭州310014)

干腌肉制品是我國傳統腌制食品的重要代表，因獨特風味而深受消費者的喜愛[1]。干腌肉制品的風味主要在加工過程中由微生物和酶共同作用產生，其中微生物菌群主要包括乳酸菌、微球菌、葡萄球菌和酵母菌等。乳酸菌作為其中的重要菌群之一，能夠發酵糖類產乳酸和一些特殊的多肽物質，對制品品質的形成和安全均具有重要意義[2]。但在干腌肉制品加工過程中，乳酸菌受到高滲透壓等環境脅迫作用而使細胞內水分外流，胞質分離，導致細胞停止生長甚至死亡[3]。此外，乳酸的積累降低了環境pH，使乳酸菌細胞內對酸度敏感的代謝關鍵酶和DNA等生物大分子受到損傷，進而影響乳酸菌自身生長和代謝。為了進一步提升乳酸菌在食品工業領域中的應用價值，提高乳酸菌在自然環境及工業生產中的耐受性，針對乳酸菌環境脅迫應激及其機制的研究越來越受到重視。

國內外對乳酸菌在不同環境脅迫下的應激機制多從細胞學和蛋白質組學的角度研究[4]，隨著對微生物群體感應系統研究的深入，從群體感應角度分析乳酸菌在環境脅迫下的應激機制也備受關注。群體感應(quorum sensing，QS)又稱為“自誘導”(autoinduction)，是一種細菌基于特定化學信號分子的濃度來監測周圍環境中自身以及其他細菌數量的變化，從而實現細菌間信息交流的機制[5]。當環境中細菌的數量積累到一定濃度時，細菌便通過信號分子發出特定信號，激活相應基因的表達，改變和協調種間或種內行為并調控某些生理功能，這一過程也叫做細胞密度依賴性的基因表達調控機制，而在調節過程中所產生的信號分子稱為自誘導素(autoinducer,AI)[6-7]。大量研究表明，細菌、真菌以及病毒中都普遍存在群體感應現象，且許多細菌的某些重要生理功能的調控都與群體感應系統有關，如色素產生[8]、生物膜形成[9]、毒力因子產生[10]、菌體發光[11]、胞外多糖合成、細胞分化[12]、細菌共生[13]和抗生素合成[14]等。本文中，筆者主要綜述了干腌肉制品中常見的乳酸菌菌株、乳酸菌群體感應系統及其分類、基于群體感應系統的乳酸菌環境脅迫應激機制等，為進一步完善環境脅迫下乳酸菌的分子調控機制、提高乳酸菌在自然環境及工業生產中的存活率和生長性能提供參考。

1 干腌肉制品中的乳酸菌菌株

乳酸菌最早由發酵肉制品中分離得到，作為傳統干腌肉制品中的主要微生物之一，其在香腸、西式火腿、侗族酸肉和腌干魚等肉制品風味和品質形成中起著重要作用。研究發現，干腌肉制品中大多數乳酸菌為乳桿菌、片球菌等，具有良好的產酸能力，且耐鹽質量分數都在10%以下，0～6%的范圍內，幾乎所有乳酸菌都可以正常生長，而能在鹽度10%以上生長的乳酸菌主要為片球菌屬和四聯球菌屬[15]。本文中，筆者將干腌肉制品中分離得到的乳酸菌及菌株特性總結于表1。

表1 干腌肉制品中分離得到的乳酸菌

1.2 乳酸菌群體感應系統及其分類

群體感應系統一般由自誘導分子、特異性受體蛋白和下游調節蛋白三部分組成[22]。根據自誘導分子的種類和相應的調控機制可將群體感應系統分為三大類，即革蘭氏陽性菌感知種內信息的由自誘導寡肽類作為信號分子(autoinducter peptide，AIP)的雙組分系統、革蘭氏陰性菌感知種內信息的由酰基高絲氨酸內酯類衍生物(AHLs)作為信號分子的LuxI/LuxR系統和細菌感知種間信息的由AI-2作為信號分子的LuxS/AI-2系統。1995年，Saucier等[23]首先在對產細菌素carnobacteriocin的棲魚肉桿菌(Carnobacteriumpiscicola)研究中發現了乳酸菌的QS系統：當carnobacterioci消失時，向體系中接種密度大于106個/mL的菌株或者直接加入carnobacteriocin會誘導菌株繼續產生細菌素，而carnobacteriocin作為其中的信號分子激活細菌素合成基因的表達。研究表明，大部分乳酸菌中不僅存在由寡肽作為信號分子的種內群體感應系統，還具備LuxS/AI-2介導的種間QS系統[24]。

2.1 寡肽介導的乳酸菌的群體感應系統

寡肽介導的群體感應系統調控著食品中乳酸菌的存活能力、細菌素合成及其在腸道中的定殖能力等重要特性[25]。此外，AIP介導的agr-Like雙組分調節系統參與了植物乳桿菌新型環肽的產生和黏附調節，但對其具體調節機制缺乏深入研究。乳酸菌主要產生Ⅰ型和Ⅱ型兩類細菌素，而目前已證實部分Ⅰ型以及多數Ⅱ型細菌素的生物合成均由QS系統調控[24]，且主要由AIP通過三組分調節系統控制，該系統除了AIP之外還包含組氨酸蛋白激酶和響應調節蛋白。

Ge等[26]從中國酸菜發酵液中分離出一株能夠產生Paracin 1.7型的細菌素的副干酪乳桿菌 HD1-7，研究表明，Paracin 1.7型細菌素的產生與HD1-7菌株的細胞密度密切相關，而且該菌株可以與其他種屬細菌共培養產生更高水平的細菌素。此外，與其他測試菌株相比，枯草芽孢桿菌具有更高的誘導菌株HD1-7產生更多Paracin1.7型細菌素的能力。

細菌素乳鏈菌肽(nisin)除了具有抗菌活性外，還具有自誘導分子的作用，在高細胞密度下，nisin通過與傳感器激酶蛋白(NisK)結合和響應蛋白相互作用而誘導QS調節的靶基因的轉錄，敲除基因簇nisA的突變菌株無法合成nisin，而向培養基中加入少量nisin則可以誘導突變菌株nisin的合成[27]。

2.2 信號分子AI-2介導的乳酸菌的群體感應系統

AI-2和其生物合成關鍵酶LuxS組成的QS系統(LuxS/AI-2系統)介導革蘭氏陽性(G+)和陰性(G-)細菌的種內和種間信息交流，AI-2是目前所知的唯一能同時進行種內和種間交流的通用語言[6]。大部分乳酸菌都含有luxS基因的同系物，且均能分泌信號分子AI-2，而不同種屬菌株產生的AI-2活性和數量存在較大差異。Park等[28]研究了泡菜樣品中分離得到的乳酸菌，證實了不同乳酸菌產生的AI-2具有不同活性。其中，L.brevis、Leuconostocgarlicum和L.plantarum分泌的AI-2活性較強，L.mesenteriodes的AI-2活性相對較弱，L.sakei和L.curvatus未檢測到AI-2活性。此外，Blana等[29]的研究不僅證實了不同菌株產AI-2的量存在差異，而且AI-2的產生受到不同包裝條件的影響，氣調包裝的牛肉中AI-2活性最低。Weiland-Br?uer等[30]發現從碎牛肉中分離的脂肪酸(亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸)對信號分子AI-2的活性具有一定的抑制作用。另外，Lu等[31]研究發現，新鮮農產品中AI-2活性高于加工食品，且乙酸鈉、苯甲酸鈉以及丙酸鈉等一些食品添加劑對AI-2活性均具有較高的抑制性。

除上述幾種因素，不同菌種間的共培養也會對菌株產信號分子AI-2造成影響。Li等[32]研究指出，與單培養相比，干酪乳桿菌協同培養增加了植物乳桿菌AB-1產信號分子AI-2的活性，luxS基因和細菌素調節操縱子(plnB和plnC)的轉錄水平均顯著增加，而且植物乳桿菌AB-1和干酪乳桿菌共培養物能顯著抑制4 ℃冷藏蝦中腐敗微生物的生長，提高產品品質。因此，推測LuxS/AI-2 QS系統可能參與調控菌株的協同合作以及植物乳桿菌 AB-1細菌素的產生。后續研究闡明AI-2對食品中有益菌和腐敗菌的生態關系則可以為基于群體感應系統抑制食品腐敗和提高食品質量提供一定參考。

近幾年來，關于LuxS/AI-2介導的QS系統調控乳酸菌方面的研究主要集中于生物膜的形成上。Moslehi-Jenabian等[33]指出，嗜酸乳桿菌生長期間產生的AI-2影響其在腸上皮細胞中的黏附能力，且與單細胞增生李斯特氏菌共培養時，嗜酸乳桿菌luxS基因轉錄水平顯著上調。Lebeer[34]構建了鼠李糖乳桿菌luxS敲除突變體，研究luxS基因在鼠李糖乳桿菌表面黏附中的作用，發現在不同環境條件下，鼠李糖乳桿菌均能在聚苯乙烯表面上形成生物膜，luxS突變菌株CMPG5412形成生物膜的能力顯著降低，說明鼠李糖乳桿菌體外生物膜形成需要luxS基因的參與。此外，Sun等[35]研究指出，雙歧桿菌的基因組序列中含有編碼與哈氏弧菌LuxS蛋白具有高度同源性的luxS基因序列，該基因可以使自身不產信號分子的E.coliDH5α產AI-2，且luxS的過表達或含有AI-2的上清液的加入促進了雙歧桿菌生物膜的形成。最近有研究發現，乳糖存在時，luxS基因在枯草芽孢桿菌生物膜的形成中不可或缺，初步推測乳糖可能通過LuxS/AI-2系統誘導枯草芽孢桿菌生物膜的形成。

3 環境脅迫下傳統干腌肉制品中乳酸菌調控機制

已有研究指出，細菌在環境脅迫作用下會通過產生信號分子AI-2以適應環境變化[36]。傳統干腌肉制品通常具有低pH、高鹽度等特點，對其中的乳酸菌及其他共存微生物會產生酸脅迫和高鹽脅迫等，但目前僅在少數幾種細菌中有關于AI-2的信號感應、傳遞及調控機制的研究報道。

3.1 酸脅迫

3.1.1 乳酸菌耐酸機制

乳酸菌生長代謝過程中會產生乳酸而降低食品體系的pH，這有利于其抑制其他菌種的生長而成為優勢菌群，但低pH在一定程度上會阻遏乳酸菌細胞中轉膜機制的能量來源并對細胞中蛋白質和DNA造成不可修復性的損傷[37]，影響其自身的生長繁殖。在脅迫作用下，乳酸菌形成了不同的應激反應機制，包括質子泵途徑、改變細胞膜結構和通透性[38]、生成堿以及生物大分子的自我修復與保護等，而具體的調節機制可能依賴于其中的一種或多種。

3.1.2 LuxS/AI-2介導的QS系統對乳酸菌耐酸機制的調控

目前關于QS系統調控乳酸菌酸脅迫應激機制的研究數量有限，但基于蛋白質組學的研究表明，乳酸菌在酸脅迫期間會誘導各種基因和蛋白質的表達，其中包括luxS基因及其調控的相關蛋白。Azcarate-Peril等[39]發現，嗜酸乳桿菌菌株與雙組分調節系統突變菌株對酸脅迫均表現出高耐受性，但突變菌株對酸更為敏感，而且酸脅迫促使突變菌株中包括luxS在內的約80個基因表達水平上調。Ming等[40]將從泡菜中分離得到的的植物乳桿菌用于草魚發酵，通過代謝組學和蛋白質組學研究發現，發酵結束時，luxS基因表達水平上調3.15倍，因此推測luxS的上調可能與發酵過程中植物乳桿菌對酸和鹽的脅迫反應有關。Wall等[41]對益生菌L.reuteri細胞的酸耐受性研究發現，超過80%的試驗菌可以在pH為 2.7時存活1 h，基因組表達分析顯示，該條件下處理5和15 min后，細菌中呈現出差異性表達的基因有72個，其中，luxS基因表達水平分別上調2～3倍和3～4倍，表明在酸脅迫作用下，L.reuteri為更好地適應酸性環境會產生更多的群體感應自誘導信號蛋白。

luxS基因的缺失會對乳酸菌的酸耐受性以及正常的生理功能產生某種影響。Sztajer等[42]研究證實了luxS基因參與變異鏈球菌酸應激反應，通過對變異鏈球菌UA159的luxS缺陷菌株全基因組序列分析發現，菌株中30%的基因表達受luxS的影響，其中涉及到菌株耐酸性、細菌素合成以及生物膜形成等。此外，Lebeer等[34]通過比較L.rhamnosusGG與其luxS基因突變株在胃汁中的存活率也證實了luxS基因可提高菌株在應對酸脅迫時的耐受性，維持較高的存活率。同樣，Jia等[43]檢測了L.plantarumKLDS1.0391的耐受性，luxS基因的缺失對菌株酸耐受性具有顯著影響，膽汁鹽測試中也呈現相同結果。然而，在正常培養條件下，與野生菌株相比，敲除luxS基因的L.plantarumKLDS1.0391菌株活細胞數量與野生菌株卻無明顯差異，但突變株的AI-2活性在培養的4～24 h生長期內明顯降低。在其他菌株中，關于luxS基因缺失對細胞數量的影響還未見報道，luxS基因對菌株酸耐受能力以及菌株正常生命活動的影響有待后續研究。

基于LuxS /AI-2 QS系統介導的乳酸菌酸應激反應中，luxS基因調控信號分子AI-2的合成，而且信號分子AI-2的活性具有一定的菌種特異性和濃度依賴性。Moslehi-Jenabian等[44]指出，隨著pH從6.5下降到3.0，4種不同乳桿菌產AI-2的活性均不斷增加，但當pH低于3.0時，L.rhamnosus的AI-2活性大于L.acidophilus，pH高于3.0時則恰恰相反，而且2菌株的luxS基因轉錄水平與AI-2活性變化規律相同。因此，推測在酸脅迫下，某些乳酸菌可通過提高luxS基因的轉錄水平來增強AI-2活性。然而，并非所有乳酸菌通過提高群體感應信號分子AI-2活性以應對酸性脅迫。Yeo等[45]研究了膽汁酸對兩株鼠李糖乳桿菌和兩株植物乳桿菌中AI-2群體感應信號系統的影響，發現1%、5%和10%膽汁酸存在時，兩株鼠李糖乳桿菌中AI-2信號分子活性顯著增加，且在1%～10%的范圍內呈濃度依賴性。相反，兩株植物乳桿菌中AI-2信號分子活性則顯著下降。對鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌酸耐受性實驗時發現，與pH為6.5的對照組相比，鼠李糖乳桿菌在pH為5.0時產AI-2活性增強，pH為8.0時產AI-2活性顯著降低，而植物乳桿菌AI-2活性無明顯變化，推測植物乳桿菌在pH為8.0時具有一定抗逆性，而酸脅迫僅對鼠李糖乳桿菌AI-2的產生具有顯著影響。

3.2 鹽脅迫

3.2.1 乳酸菌耐鹽機制

在食品生產過程中，高濃度鹽的添加不僅能夠抑制一些致病菌和食品腐敗微生物的生長，延長食品保質期，而且能滿足干腌肉制品的風味要求。但高濃度鹽也會對乳酸菌的生長代謝產生不利影響，鹽脅迫通過改變細胞外界的滲透壓，導致乳酸菌細胞體積減小和結構損傷，造成細胞生理代謝活動的紊亂甚至死亡[38]。目前，對不同來源乳酸菌調節胞內滲透壓機制的研究主要集中在相容性溶質調控系統、熱休克蛋白調控系統、糖酵解關鍵酶調控系統以及胞內離子平衡這幾個方面。

3.2.2 LuxS/AI-2介導的QS系統對乳酸菌耐鹽機制的調控

近幾年來，LuxS/AI-2 QS系統介導乳酸菌的鹽脅迫應激反應也僅在少數幾種乳酸菌中被初步證實。Lin等[46]從中國傳統發酵肉制品中分離得到L.plantarumF、L.sakeiL4和L.plantarumR3種乳酸菌菌株，培養過程中均可產生信號分子AI-2。qRT-PCR分析表明，LuxS/AI-2 QS系統參與了這3株乳酸菌的鹽脅迫應激反應，高濃度硝酸鹽脅迫下，所有菌株luxS基因的表達均顯著上調，其轉錄水平與鹽濃度呈正比。然而，在相同鹽濃度下，3種菌株luxS基因表達水平的增加量卻不同，可能是由于不同菌株對鹽的耐受性不同。李博[36]對滲透壓脅迫是否誘導菌株L.fermentum2-1和E.faecium8-3的LuxS/AI-2 QS系統發揮調控作用的研究表明，不同滲透壓培養時，L.fermentum2-1和E.faecium8-3的生長均受到高滲透壓的抑制，菌體密度呈下降趨勢，與信號分子AI-2的產生呈正相關，說明在滲透壓脅迫下，兩菌株主要通過影響菌體密度來促進或抑制信號分子AI-2的產生。關于滲透壓脅迫對L.fermentum2-1和E.faecium8-3產AI-2活性以及關鍵基因的轉錄影響，顧悅[47]進行了進一步闡明，輕度滲透壓時，信號分子AI-2活性隨培養時間延長逐漸減弱，菌株一旦適應環境，AI-2的活性增強；重度滲透壓時，AI-2的活性顯著降低且不隨著培養時間延長而增加。綜上所述，滲透壓的脅迫作用達到一定閾值后，即使培養時間延長，菌株仍不能很好地適應不良環境，但無論滲透壓的作用強度如何，luxS和pfs基因轉錄水平均與滲透壓呈正相關。

Liu等[48]研究表明，luxS基因的過表達促進了L.paraplantarumL-ZS9信號分子AI-2的產生，同時也增強了菌株對膽鹽的耐受性以及生物膜的形成，并調控多種基因和蛋白質的轉錄與表達，這些結果可為揭示luxS基因在促進益生乳酸菌抗逆性和生物膜形成中的作用提供一定參考。但目前，luxS基因是僅在甲基循環中發揮作用，還是作為信號分子 AI-2 的關鍵合成基因行使 QS 功能仍是研究的熱點與難點。姜黎明等[49]從云南傳統發酵豆豉中分離鑒定出一株益生效果較好的L.plantarum，全基因組序列測定發現，該菌株具有2個luxS基因，初步推測一個參與甲基代謝；另一個則通過群體感應系統調控菌株耐受性，而與群體感應相關的luxS基因和參與甲基循環代謝相關的luxS基因是不是同一個基因至今還不得而知。

3.3 其他脅迫

除高鹽脅迫和酸脅迫外，干腌肉制品中乳酸菌還會受到其他環境脅迫作用的影響。如嗜溫乳酸菌在加工和儲藏過程中會受到高溫或低溫的溫度脅迫，而且營養代謝以及環境中的氧等都會對乳酸菌產生一定影響；如碳源、氮源的種類與含量以及磷酸鹽的比例等都會導致乳酸菌產生營養脅迫，乳酸菌通過限制核苷酸合成，誘導與氨基酸代謝相關蛋白的產生來調控菌株生理狀態和代謝水平[50]；乳酸菌中氧脅迫由特定轉錄子調控，激活或抑制某些蛋白質的合成代謝，從而使菌體免受損傷。

作為參與菌體代謝的重要調節機制，從LuxS/AI-2 QS系統的角度研究乳酸菌不同環境脅迫下的應激機制具有重要意義，但目前關于這方面的研究相對缺乏，仍處于初步研究階段。比如：luxS基因的過表達在促進L.paraplantarumL-ZS9信號分子AI-2產生的同時，也增強了菌株的熱耐受性，這一結論在Liu等[48]研究中證實。近年來，其他種屬乳酸菌菌株中關于溫度和營養脅迫對菌株產信號分子AI-2的影響也有報道。李博[36]研究發現，隨著溫度升高，L.fermentum2-1和E.faecium8-3菌體密度與信號分子AI-2的產生均相應增加，說明溫度脅迫主要是通過影響菌體密度來介導信號分子AI-2的產生。隨著營養濃度的降低，L.fermentum2-1和E.faecium8-3的菌體密度下降，但低營養脅迫會誘導乳酸菌產生更多信號分子AI-2，說明此時菌體密度不是誘導信號分子AI-2產生的主要因素。同時，營養脅迫對AI-2的活性表現出一定的菌種特異性。Yeo等[45]指出，不含碳源的培養基中生長的鼠李糖乳桿菌的AI-2活性顯著低于對照組(含2%半乳糖)，加入0.5%的半乳糖后可恢復到與對照組相似的活性水平，而含1%半乳糖的AI-2活性顯著高于對照組；對于植物乳桿菌，不含碳源情況下檢測到的AI-2活性顯著高于其他條件下的濃度，且隨著半乳糖濃度增加，其AI-2活性則逐漸降低。研究表明，營養脅迫在誘導菌株信號分子AI-2活性增加的同時，也會誘導luxS和pfs基因轉錄水平的升高。Gu等[51]對luxS和pfs的轉錄水平以及信號分子AI-2的研究發現，稀釋的MRS培養基中AI-2活性顯著高于對照組。營養濃度最低的培養基中檢測到最高的AI-2活性，且luxS和pfs基因的轉錄水平分別是對照組的2.3倍和1.6倍。這些研究結果為探究LuxS/AI-2介導的QS系統參與乳酸菌營養脅迫應激反應提供了參考依據。但目前鮮有LuxS/AI-2介導的QS系統對乳酸菌應對氧脅迫時信號分子以及關鍵合成基因的變化研究，與之相應的應激機制更未見報道。

4 總結與展望

目前關于環境脅迫下群體感應調控乳酸菌應激機制的研究仍相對缺乏，基于群體感應信號分子的多樣性及其調控機制的復雜性，將來在理論研究方面仍有很多問題亟待解決，筆者認為主要體現在以下幾個方面：①由群體感應系統介導乳酸菌形成的生物膜以及細菌素是否會影響到乳酸菌在胃腸道及食品生產過程中的環境耐受性；②乳酸菌在應對相同環境脅迫時，信號分子AI-2的活性和luxS基因的轉錄水平為何呈現菌種差異性；③群體感應系統介導調控哪些基因的轉錄以及蛋白質的表達參與乳酸菌環境應激反應；④同種屬乳酸菌在應對不同環境脅迫時，與群體感應系統相關的基因表達和蛋白質的轉錄是否存在差異性等。另外，雖然基于QS系統調控乳酸菌環境脅迫應激機制已有初步研究，但要將研究成果運用于實際生產中還有很長的路要走。隨著基因組、轉錄組、蛋白質組學和代謝組學等現代生物技術被成功應用在多種微生物研究中，對乳酸菌群體感應系統的研究也在不斷深入，有望為食品工業中定向提高菌株的生產性能奠定理論基礎。