細菌群體感應及其調控應激反應的研究進展

李鵬飛，武瑞赟，李平蘭

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083)

每個細菌自身都可以分泌一種化學信號分子，可以在細胞內外環境中自由擴散，從而分布于細菌的生長環境中。由于這些信號分子由菌體自身分泌并能調節菌體生長行為，所以被稱為自誘導因子[1](autoinducers，AIs)。自誘導因子的濃度隨著細胞密度的增加而增加。在細菌的細胞質或細胞膜上存在著自誘導因子的受體，能夠實時感受自誘導因子濃度的變化，自誘導因子濃度一旦達到閾值，細菌就會利用細胞間通信協調它們的行為及相關表型的表達，這種現象被稱作群體感應[1](quorum sensing，QS)。現已證實，QS系統對于細菌具有多種調控功能，如：細菌運動[2]、致病菌毒力因子的產生[3]、生物被膜形成[4]、菌體發光[5]、抗生素及色素的產生[6]和細菌素的產生[7]等。近年來一些研究表明，QS系統對細菌的應激反應也可能具有一定的調控功能。細菌的應激反應是指細菌對外界環境脅迫表現出的各種特定的、高度調節的適應性反應[8]。這些反應不僅可以保護細菌本身不受脅迫影響，而且能使得細菌對固有抗菌素的敏感性發生變化。對細菌應激反應展開研究，既有助于對致病菌的生長進行抑制，也有助于提高益生菌在食品加工生產中的生存能力。

1 細菌的QS系統

一般來說，細菌的QS系統主要分為3類：革蘭氏陽性菌特有的QS系統、革蘭氏陰性菌特有的QS系統以及革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌共有的QS系統。此外，在某些腸道病原體中還存在由信號分子AI-3誘導的QS系統，但相關研究較少，其分子結構及調節機制都有待研究[9]。

1.1 革蘭氏陽性菌QS系統

革蘭氏陽性菌QS系統中的自誘導因子是自誘導短肽(autoinducing peptides，AIPs)。細胞中產生的AIPs達到一定閾值時，會與位于細胞膜上的特異性受體分子結合，從而激活組氨酸激酶雙元信號轉導系統的激酶活性，使受體磷酸化，之后將受體傳遞給細胞質中的反應調控蛋白，被磷酸化的反應調控蛋白與DNA上的基因啟動區結合，從而觸發QS系統調控的基因表達[10]。

不同菌體及不同QS系統的AIPs具有一定的差異，這種特異性主要是由氨基酸排列順序的不同以及空間結構的差異決定[11]。因此，由AIPs介導的QS系統是細菌種內交流的一種方式。

1.2 革蘭氏陰性菌QS系統

革蘭氏陰性菌QS系統中最常見的自誘導因子是N-乙酰-L-高絲氨酸內酯(N-acyl homoserine lactones，AHLs)。不同菌種所產AHLs不同，其差異主要在于?；鶄孺湹拈L度與結構，而高絲氨酸內酯部分是相同的[12]?？梢?，由信號分子AHL介導的QS系統也主要用于細菌的種內交流。

AHLs通常是由AHLs合成酶LuxI型蛋白以S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)和?；；d體蛋白(acylated acyl carrier protein，acyl-ACP)為底物合成的[12]。當AHLs的濃度達到一定閾值時，會與特異性受體結合并激活轉錄調控因子LuxR[13]。之后，LuxI-LuxR蛋白復合體與DNA的基因啟動子區結合，從而觸發QS系統調控的基因表達[14]。

1.3 革蘭氏陽性菌和陰性菌共有的QS系統

革蘭氏陽性菌和陰性菌共有的QS系統中的自誘導因子為AI-2。Winzer等[15]研究證實，細菌中產生AI-2的生物合成途徑是高度保守的。一般情況下，SAM作為甲基供體，先被催化生成S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)，然后通過pfs編碼的S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocysteine nucleosidase，SAH’ase)的作用迅速水解為腺嘌呤和S-核糖同型半胱氨酸(S-ribosylhomocysteine，SRH)。由luxS基因編碼的S-核糖同型半胱氨酸酶將SRH轉化為同型半胱氨酸和4,5-二羥基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD)，DPD會自發重新排列形成AI-2[16]。

在許多革蘭氏陽性菌和陰性菌中都存在AI-2的生物合成基因luxS及其同源基因[17]。因此，信號分子AI-2可以用于細菌的種間交流?，F已確定AI-2調控的細菌功能有毒力因子、白細胞毒素、鐵獲取、蛋白的表達、細菌的運動性、細胞分裂、DNA加工、菌血癥感染、生物被膜形成和生物發光等[18]。

2 細菌QS系統對應激反應的影響

從分子水平上講，細菌在面對環境脅迫時所表現出的應激反應是一個復雜的反應過程，其基因組中的多種基因都會參與其中[19]。例如，對變形鏈球菌的研究發現，溫度升高時，有40種蛋白的表達量升高；而對培養基進行稀釋會誘導58種蛋白的合成，另外有20種蛋白表達量降低[20]。研究細菌的應激反應，就是為了找出在此過程中發揮關鍵性作用的基因或蛋白，從而設法控制這些基因的表達或抑制相關蛋白質的活性，最終實現對細菌應激反應的控制[20]。通過研究細菌QS系統對應激反應的影響，可以為這些基因或蛋白的尋找提供新的途徑。

2.1 幾種常見致病菌的QS系統對應激反應的影響

2.1.1 霍亂弧菌

霍亂弧菌是革蘭氏陰性菌，主要存在于水環境中，可引起霍亂。Yildiz等[21]研究發現，霍亂弧菌在水環境中的生存主要受RNA聚合酶Σ因子RpoS的調控，RpoS的高表達可以提高霍亂弧菌對氧化脅迫和低營養脅迫的耐受性。RpoS也被證明可以增加霍亂弧菌QS系統中中樞調節蛋白HapR的表達，該蛋白調控著許多與霍亂弧菌發病機制和環境生存有關的生理功能[22]。Joelsson等[23]進一步研究發現，霍亂弧菌的QS系統通過調節蛋白HapR上調了RpoS蛋白的表達量，并增強了霍亂弧菌在氧化脅迫下的應激反應。可見，QS系統中的HapR可以增強霍亂弧菌的應激反應，通過抑制HapR的活性可以降低霍亂弧菌的生存能力。

2.1.2 變形鏈球菌

變形鏈球菌是齲齒的主要病原體[24]。Wen等[25]對變形鏈球菌的研究發現，luxS缺陷菌株對酸脅迫的耐受性下降，但仍能進行酸適應。此外，Leung等[26]的研究表明，鏈球菌中存在由感受態刺激肽(competence-stimulating peptide，CSP)介導的QS系統，而CSP很可能是一種應激誘導信息素，通過觸發對細菌群體的信號，啟動適應性反應(圖1)。CSP前肽由特定的ABC轉運體ComAB加工并輸出到細胞外環境中，SepM蛋白酶負責最后的出口后加工過程。當成熟CSP積累超過閾值濃度時，它與位于膜上的ComD受體結合，觸發其自磷酸化，隨后通過磷酸化激活同源細胞質反應調節劑ComE。盡管CSP和XIP信號通路之間的相互聯系還不完全清楚，但有研究已經證明了由ComE直接調控的cipB基因對于激活SigX非常重要[27]，而SigX可以提高細菌的應激能力。

圖1 變形鏈球菌中CSP介導的QS系統[26] Fig.1 CSP-mediated QS system in Streptococcus mutans[26]

Leung等[26]還證實，菌種通過CSP信息素的分泌來應對各種不利環境的脅迫，包括高溫脅迫、氧化脅迫、酸脅迫和低營養脅迫，甚至可以用來應對抗生素的治療。可見，luxS基因和CSP均可以作為降低變性鏈球菌應激反應的突破口。

2.1.3 大腸桿菌

致病性大腸桿菌是我國食源性疾病的主要病原體之一[28]。DeLisa等[29]對EscherichiacoliW3110的研究發現，Fe3+、NaCl和二硫蘇糖醇(DTT)濃度的增加均會誘導該菌株所分泌的AI-2活性上調，這種上調是在種群密度和生長速率均未改變的情況下發生的。而一些環境脅迫(高溫脅迫、乙醇、氧化脅迫、絲氨酸羥胺、乙酸鈉、O2以及人白細胞介素-2過表達)不僅會導致AI-2活性下降，而且可能使AI-2發生降解或抑制AI-2的活性。

Park等[30]對腸道出血性大腸桿菌(EHEC)的研究得到一個有趣的結論，在滲透應激條件下，luxS缺陷突變株的生長率要高于野生型菌株，進一步研究發現，滲透應激使得野生型菌株細胞變形嚴重，細胞外膜的邊界出現不清楚和不均勻(圖2(a))，而luxS缺陷突變株的細胞則沒有表現出外膜表面的損傷(圖2(b))，當向luxS缺陷突變株中添加AI-2時，菌株的生長速率會降低，細胞變形加劇。這些結果都說明AI-2降低了EHEC對滲透脅迫的應激反應。這并非是個例，Wen等[25]對變形鏈球菌的研究也發現，luxS缺陷菌株對氧化應激的耐受性出現了上升趨勢。這說明AI-2信號分子不僅可能會增強細菌的應激能力，對于某些菌株以及在特定的脅迫條件下，也會降低細菌的應激能力。

圖2 電場發射掃描電子顯微鏡下的圖像[30] Fig.2 Field emission scanning electron analysis (FE-SEM) image[30]

2.1.4 其他致病菌

桂萌[31]對維氏氣單胞菌LP-11的研究發現，使用淬滅酶阻斷菌株的QS系統后，細胞代謝活性下降，對于環境的適應力也隨之下降。對哈氏弧菌的研究發現，QS系統調節蛋白LuxR激活了甘氨酸甜菜堿操縱子betIBA-proXWV，這增強了哈氏弧菌在滲透脅迫條件下的生長[32]。對溶藻弧菌的研究發現，在高溫條件下，響應溫度應激相關蛋白的表達量顯著上調，而對于這些蛋白的調控依賴于QS系統的中樞調控蛋白LuxR[33]。對于哈氏弧菌和溶藻弧菌來說，LuxR蛋白均為提高其應激反應的關鍵性蛋白。

以上研究均表明，QS系統對所研究菌種的應激能力具有一定的調節作用。但也有實驗表明了相反的觀點，如Turovskiy等[34]對單增李斯特氏菌的研究發現，添加食品防腐劑乳酸鏈球菌素并不會導致AI-2活性上升，同時AI-2處理的細胞對傳入的應激也沒有更大的抵抗力。這說明AI-2誘導的QS系統對其應激能力的調節沒有起到效果，然而單增李斯特氏菌中是否存在其他信號分子介導的QS系統對應激能力的調節機制還有待研究。

2.2 QS系統對乳酸菌應激反應的影響

乳酸菌是一類能從可發酵性碳水化合物產生大量乳酸的革蘭氏陽性菌的統稱，其既可以定居于腸道內維持腸道內環境的平衡，也可以應用于發酵工業中[35]。但不論是在人體腸道[36]或是在發酵食品的生產應用過程[37]中，乳酸菌往往都會經受各種環境脅迫，這就使提高乳酸菌的應激能力顯得至關重要。

通過AI-2活性介導的QS系統在乳酸菌的酸性應激反應中具有明顯的作用。Moslehi-Jenabian等[38]研究發現，在標準生長條件下，不同乳酸菌的AI-2活性水平似乎不同，但當暴露在酸脅迫環境時，AI-2活性增加，并且luxS基因的轉錄顯著增加。Gu等[39-40]對菌種L.fermentum2-1和E.faecium8-3的研究同樣發現，酸脅迫會導致AI-2活性增加，同時，酸脅迫還會導致luxS和pfs基因過度表達。

滲透壓脅迫下，乳酸菌AI-2活性的變化出現了差異。Gu等[39-40]的研究還發現，隨著滲透壓的不斷增大，AI-2的活性受到抑制。但Yeo等[41]的研究發現，他們實驗用的4株乳酸菌的信號分子AI-2活性均隨滲透壓的增大而增大。這表明菌株對滲透壓脅迫的應激反應存在菌株特異性。

可見，針對QS系統對乳酸菌應激反應影響的實驗較少，相關研究僅僅表明環境脅迫使得QS系統信號分子AI-2的活性發生變化，并未說明這種產量變化會對乳酸菌的應激反應產生何種影響。QS系統對乳酸菌應激反應的具體作用及作用機制都有待研究。

3 總結與展望

細菌的應激反應提高了其在環境脅迫下的生存能力，研究細菌應激反應的影響因素不論對于致病菌還是益生菌都具有重要意義。細菌QS系統及其信號分子，為尋找在細菌應激反應過程中發揮關鍵性作用的蛋白及基因提供了一條新的途徑，也為應對致病菌及益生菌對環境脅迫存在的應激反應提供了一種新方法。目前針對細菌QS系統對應激反應影響的相關研究主要集中在致病菌，乳酸菌的相關研究則很少。雖然細菌QS系統的多樣性以及應激反應表現出的菌株特異性都為研究的開展設置了障礙，但相信隨著相關研究的深入，這些難題都會迎刃而解。