群體感應系統調控乳酸菌細菌素合成的研究進展

黃雨霞，武瑞赟，李平蘭

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083)

乳酸菌通常被認為是食品級微生物，其產生的細菌素、胞外多糖等代謝產物通常被認為是安全的(GRAS，一級)[1]。其中，細菌素是乳酸菌的次級代謝產物，是代謝過程中由核糖體合成的一類具有抗菌活性的蛋白質或多肽，它們具有對熱穩定、對蛋白酶敏感、分子量(<1.0×104)較小等特點，經過翻譯后修飾[2]，具有廣譜的抑菌活性，因此作為一種天然的食品防腐保鮮劑被廣泛研究。對于目前報道的乳酸菌細菌素主要分為三類[3]：①Class Ⅰ細菌素。屬于羊毛硫抗生素，含有羊毛硫氨基酸，A型較細長，螺旋形，帶正電荷，兩親分子，比如乳酸鏈球菌素(Nisin)；B型為球狀結構，沒有凈電荷。②ClassⅡ細菌素。屬于非羊毛硫抗生素，相對熱穩定，又可分為Subclass Ⅱa和Subclass Ⅱb兩種。Subclass Ⅱa對以單增李斯特氏菌為代表的革蘭氏陽性菌有良好的抑菌活性；Subclass Ⅱb 一般由2條多肽鏈組成，它們需要2個肽協同作用才能產生抗菌活性。③Class Ⅲ細菌素。熱不穩定的蛋白質。

Nisin是唯一被糧食和農業組織/世界衛生組織(FAO/WHO)認定為安全并批準用于食品中的細菌素[4]。乳酸菌細菌素合成量低是限制其應用的主要原因，已有的研究表明，乳酸菌細菌素的合成受群體感應的調控，且三組分系統發揮了核心的作用。乳酸菌細菌素對保障食品質量安全和人體健康具有重要意義，揭示其群體感應的合成調控機制有助于實現細菌素的大量生產。因此，本文中，筆者總結群體感應系統及其調控乳酸菌細菌素合成的三組分系統的研究進展，以期為研究者提供參考。

1 群體感應

在乳酸菌細菌素合成過程中，群體感應(QS)系統發揮了關鍵的調控作用，通常認為QS是一種細胞間通信過程(cell-to-cell communication)，使細菌能夠共同改變行為以響應細胞密度和物種的變化，首次發現于海洋生物Photobacteriumscheri在高細菌密度下可以產生的發光現象[5]。群體感應涉及細胞外信號分子的產生、釋放和范圍檢測，這種信號分子被稱為群體感應信號分子(quorum sensing molecular，QSM)或自誘導物(autoinducer，AI)。隨著細菌種群密度的增加，信號分子在環境中不斷積累，細菌監測信號分子濃度變化，以感知細胞數量的變化，并共同調控基因表達[6]。QS在調節細菌活力、抗生素生物合成、生物膜形成、質粒接合以及其他毒力因子的產生方面起到重要作用[7]。根據信號分子和受體蛋白不同將群體感應分為4類[8-9]：①N-酰基高絲氨酸內酯類(AHL)介導的 LuxI/R群體感應系統；②寡肽類(autoinducing peptide,AIP)介導的群體感應系統；③AI-2介導的LuxS /AI-2 群體感應系統；④AI-3 和假單胞菌喹諾酮信號(Pseudomonasquinolone signal，PQS)介導的群體感應系統。調控乳酸菌細菌素合成的群體感應主要屬于第②類和第③類，且三組分系統在其中發揮重要作用。

早在1999年研究就發現，調控乳酸菌細菌素合成的是由三組分群體感應系統調控的。之后Maldonado等[10]研究證明，三組分系統是調控乳酸菌細菌素合成的主要群體感應調控系統，很多對乳酸菌細菌素合成的研究都基于三組分系統。三組分系統通常由一個雙組分系統(two component system，TCS)和一個信號分子組成，其中TCS由位于膜上的組氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase，HPK)和調節特定基因表達的反應調節蛋白(response regulator protein，RR)組成[11]，其調控機制在Class Ⅰ和Class Ⅱ類乳酸菌細菌素具有相似性和特異性，揭示三組分系統對其合成的調控機制對于乳酸菌細菌素的研究應用具有重要的意義。

2 三組分系統對乳酸菌細菌素的合成調控

2.1 三組分調控系統的組成

2.1.1 信號分子

構成三組分系統的信號分子為寡肽類，也被稱為自動誘導肽(AIP)，其在中性條件下以陽離子形式存在，凈電荷為3～6，長度為19～26個氨基酸殘基，其中疏水殘基含量較高。自誘導肽信號的合成發生在細胞核糖體中，并通過進一步修飾加工，以達到成熟形式[12]。Maldonado-Barragán等[13]通過研究LactobacillusplantarumNC8證實其自誘導分子具有高特異性，這與Brurberg等[14]的研究具有相同的結果，表明微生物產生的AIP在任何菌株中都不能互換。Syvitski等[15]設計并合成了一系列截短的以及氨基酸取代的信號肽，用圓二色譜和核磁共振技術分析比較了變異鏈球菌(S.mutans)信號肽的結構與其誘導活性之間的關系。但到目前為止，信號肽的結構與功能的關系還不是很明確。

2.1.2 雙組分系統

TCS是調控細菌素合成的典型的信號轉導途徑，通常由與膜結合的傳感器HPK和細胞質反應調節蛋白RR組成，2種蛋白質均呈現模塊化結構。HPK是具有跨膜螺旋的跨膜整合膜蛋白，通常由感覺結構域、組氨酸-磷酸轉移(DHP)結構域(含有可磷酸化的His殘基)和ATPase(CA)結構域(ATP結合位點并催化DHP結構域的磷酸化)組成。RR由保持保守的天冬氨酸殘基的受體域(CRC)和通常是DNA結合域的效應域組成。反應調節蛋白中磷酸基的水解使系統對外界刺激做出反應。水解過程可以通過RR 的自磷酸酶或HPK的磷酸酶介導，也可以通過天冬氨酸磷酸酶介導[16]。通過該過程，磷酸基團轉移至響應調節劑的天冬氨酸，最后作為無機磷酸鹽釋放。磷酸化的反應調節劑與啟動子結合，激活細菌素基因和三組分系統基因的表達。

Zuniga等[17]首先依據19個乳酸菌的基因組序列研究了乳酸菌的TCS的種類和數量。Monedero等[18]在此基礎上，用MBGD中98個完整的基因組序列以進行比較分析，將HPK分為ⅢA、HPK10、Ⅱ、Ⅵ、和CheA/HPK9這5類，RR分為OmpK、LytR、Narl、CitB、YcbB、AraC、CheY和CheB這8類。在乳酸菌TCS里HPK中的ⅢA和RR中的OmpK含量最豐富(在TCS中占71.45%)。

2.2 三組分調控系統調控細菌素合成的機制

2.2.1 ClassⅠ類乳酸菌細菌素的合成調控

ClassⅠ類乳酸菌細菌素的典型代表是Nisin，Nisin是一種由乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactissubsp.lactis)合成的細菌素。調控Nisin合成的群體感應系統是非典型的三組分調控系統，被稱為NICE(Nisin controlled expression)系統。Kleerebezem等[19]綜述了產生乳鏈菌肽的菌株攜帶的基因，含有乳鏈菌肽(nisA)結構基因，TCS(nisK-R)和其他參與乳鏈菌肽修飾，輸出和免疫的基因的基因簇。在三組分調控系統中，Nisin本身作為寡肽類信號分子，激活包括nisA在內的整個nis簇的誘導，主要有參與蛋白質修飾的nisB和nisC；與ABC轉運蛋白相關的nisT；用于去除前導肽的胞外蛋白酶的nisP；與跨膜信號轉導相關的nisK；響應監管相關的nisR；與免疫相關的nisE、nisF、nisG和nisI(圖1)[20]。TCS中的 RR屬于OmpR族，HPK屬于ⅢA族[18]。

圖1 Ⅰ類細菌素合成的群體感應調控系統[20] Fig.1 Quorum sensing system regulating the synthesis of classⅠbacteriocin[20]

2.2.2 ClassⅡ類乳酸菌細菌素的合成調控

調控Ⅰ類和Ⅱ類乳酸菌細菌素合成的三組分調控系統有相似性但也有特異性，其相同之處在于三組分系統的組成都是由自誘導肽、組氨酸激酶和反應調節蛋白組成，但3種組成成分具有明顯的差異。在Ⅰ類乳酸菌細菌素的三組分系統中，自誘導肽是抗菌肽本身，而Ⅱ類細菌素的自誘導肽是由特定基因簇編碼的，且不同的菌株的編碼基因簇不同。最典型的基因簇為plnABCD，plnA編碼自誘導肽AIP，plnB編碼組氨酸激酶，plnC和plnD編碼2種反應調節劑，張香美等[21]制備類植物乳桿菌L-XM1不產細菌素表型,用人工合成的PlnA誘導其產生了細菌素,確定PlnA在類植物乳桿菌L-XM1細菌素合成中的作用,之后又通過克隆并插入plnB基因,發現plnB敲除突變體ΔplnB21喪失了產細菌素的能力,即使在加入PlnA后,其產細菌素型也不能恢復[22]。存在類似pln基因簇的L.plantarum菌株包括C11、WCFS1、J51、NC8、J23、 I-UL4、V90。L.plantarumC11中的調節操縱子是典型的plnABCD基因簇編碼的三組分系統[23]。L.plantarumWCFS1 的基因組序列顯示，它的pln基因簇的結構和序列與 C11 菌株一致，所以與 C11 具有相同的群體感應調節機制[24]。L.plantarumJ51與C11的操縱子存在差異，但編碼三組分系統操縱子都為plnABCD[25]。與C11中的pln調節操縱子不同，L.plantarumNC8調節操縱子僅包含3個基因：編碼自誘導肽的plnNC8IF，HPK的plnNC8HK和RR的plnD，其中NC8-plnD與C11-plnD具有高度的相似性[26]。L.plantarumJ23 與NC8具有相同的調控三組分的基因操縱子[27]。而L.plantarumI-UL4中的三組分基因操縱子與以上2種情況不同，其操縱子為plnUL4IF-plnUL4HK-plnD，但其與NC8和J23相似的結構，調控方式也基本相同[28]。除此之外，有研究發現L.plantarumV90具有組合性生產的特點[29]。由此可見，調控乳酸菌細菌素合成的三組分系統基因具有多樣性的特點。

與控制乳球菌中Nisin產生的TCS相比，調節Ⅱ類細菌素產生的TCS具有不同的特征。首先，TCS的RR屬于LytTR家族，Nikolskaya等[30]借助分子生物學技術研究了LytTR攜帶的N端保守的DNA結合域與其他RR攜帶的經典螺旋-轉角-螺結構不同。其次，它的同源HPK屬于HPK10系列傳感器激酶[16]。與其他HPK相比，HPK10族具有不同的特征，Johnsborg等[31]研究證明HPK10在N端傳感器域中存在5～8個預測的跨膜螺旋，是肽類激素的受體。這與位于胞漿外環兩側的2個典型跨膜螺旋不同。

圖3為Ⅱ類細菌素合成的群體感應調控系統的示意圖。

圖2 Ⅱ類細菌素合成的群體感應調控系統[32] Fig.2 Quorum sensing system regulating the synthesis of classⅡ bacteriocin[32]

3 其他介導群體感應調控的因素

在乳酸菌細菌素的群體感應調控系統中，三組分調控系統發揮了核心作用，但還存在其他影響細菌素合成的因素，比如細菌密度和共培養的影響。關于細菌素合成的研究表明，一些產生細菌素的乳酸菌(Bac+)在以非常低的細胞密度接種時可以變成非產生菌株(Bac-)，在以高細胞密度接種時，向生長培養基中添加Bac+變異體(含誘導肽)或含純化誘導劑肽的上清液或與特定細菌共培養時，而這些菌株又可以恢復細菌素生產能力[33-34]。但Bac+表型的恢復只能在固體培養基上實現，比如L.plantarumWCFS1突變株只有添加植物乳桿菌素A(PlnA)后通過將培養物涂布在固體培養基上才能恢復產細菌素能力[35]。據推測，在固體表面上的生長類似于細菌的自然生長，細菌在自然環境中通常在表面上形成生物被膜，這些生理條件可能影響與細菌素誘導相關的基因的表達。

有研究表明，乳酸菌細菌素的產生可通過共培養誘導或增強，相關菌株包括Lactobacillussalivarius、Lactobacillusacidophilus、Enterococcusfaecium和L.plantarum等[36-38]。以L.plantarumNC8為例，特定的革蘭氏陽性細菌的存在可以作為環境刺激因子，共培養時能夠激活PLNC8生產并增強PLNC8-自誘導活性，從而在沒有誘導細胞的情況下觸發細菌素的生產[39]。從這個意義上講，調節細菌素合成的QS系統能夠以某種方式感知產生誘導肽的細菌的數量。Autoinducer-2(AI-2)在許多情況下與共培養誘導產生細菌素有關[40]。 AI-2是通過luxS基因產物的催化作用合成的S-核糖基同型半胱氨酸的分解代謝的副產物[41]，已被證明是介導Bac+菌株共培養中細菌素產生的誘導信號分子。Jia等[42]提出AI-2作為L.plantarumKLDS1.0391中細菌素產量增加的間接觸發因素，其產生依賴于plNC8HK-plnD基因。當L.plantarumKLDS1.0391與細菌素產生菌L.helveticusKLDS1.0207共培養時，可觀察到plnNC8HK和plnD基因的顯著上調，這種基因表達的上調導致細菌素活性增加，且與AI-2活性正相關。Di Cagno等[43]研究表明，在與LactobacillusrossiaeA7共培養條件下，L.plantarumDC400中luxS基因表達顯著升高，上清液中AI-2誘導物的活性增強。盡管如此，AI-2與細菌素生產之間的直接聯系尚不明確。

4 展望

目前乳酸菌細菌素的群體感應的研究主要集中在基因和結構方面，從當前的研究結果看，三組分調控系統在介導乳酸菌細菌素合成方面發揮著重要的作用，然而三組分的結構和功能的相關性以及不同類型的菌株調控基因的差異性還有待進一步的研究。同時，還有很多尚未識別的環境因素在調節信號分子的產生或細胞對信號分子的敏感性方面發揮作用，AI-2在細菌素合成調控過程中的信號輸出、接收或轉導途徑等具體作用機制有待闡明。調控乳酸菌細菌素合成基因具有多樣性，還有很多復雜的環境因素在其中發揮作用，因此目前沒有找到通用的調控系統。加強基因多樣性、環境因素以及共培養機制的研究對提高細菌素產量具有重要意義。