微生物群體感應系統的調控機制及應用研究進展

周 朋，王 喆，包美嬌，董明盛，吳俊俊

(南京農業大學食品科技學院，江蘇南京210095)

微生物之間可以通過自身合成特殊的信號分子，以實現種內和種間的交流，來啟動特定基因的表達，從而控制整個群落的狀態，目前一般將這種現象稱為群體感應(quorum sensing,QS)。自體誘導物(autoinducer,AI)[1-2]是具有擴散性，且可以被微生物感應到的信號分子。AI的濃度會隨著細胞密度的增加而不斷提高，達到一定的濃度后，可以和胞內的受體蛋白相結合形成信號分子——受體蛋白復合體，復合體可以和QS系統啟動子結合，并調節下游控制細胞群落密度的基因的表達量。因此，AI可以視作微生物之間交流的語言，不同種類微生物的語言不同。革蘭氏陰性菌中的AI通常為酰基化的高絲氨酸內酯類化合物(acyl-homoserineLactone,AHL)[3-4]。在革蘭氏陽性菌中的AI為氨基酸和短肽類物質(autoinducing peptides，AIPs)[2,5]。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均可以感應由luxS基因表達產生的4，5-二羥基-2，3-戊二酮(AI-2)系列的自體誘導物分子，實現革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌種間的交流[6]。

本文中，筆者介紹了革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的代表性群體感應系統以及群體感應系統在動態學調控、致病菌防治以及食品防腐領域的研究現狀。

1 代表性的群體感應系統

費氏弧菌以及銅綠假單胞菌均為革蘭氏陰性菌，通過AHL類信號分子調控群體感應；糞腸球菌以及金黃色葡萄球菌均為革蘭氏陽性菌，通過AIP類信號分子調控群體感應。它們的群體感應系統目前研究得比較清晰，并且非常有代表性，在發酵工程動態調節、致病菌防治等領域也多有應用，因此本文中，筆者選擇這4株菌作為代表，簡介其QS系統及相關基因調控元件。

1.1 費氏弧菌的LuxI/R群體感應系統

來自海洋的發光細菌費氏弧菌(Vibriofischeri)是一種革蘭氏陰性菌，通過高絲氨酸內脂介導的QS調節生物發光，并且借助這一特性和許多真核宿主建立起共生關系。費氏弧菌群體感應系統如圖1所示。費氏弧菌中的LuxI/R群體感應系統由luxicdabe、luxr兩個操縱子組成[2,7]。luxi負責編碼信號分子蛋白LuxI，參與信號分子3-oxo-C6-HSL的合成，正常情況下有痕量表達。luxr負責編碼信號分子受體蛋白LuxR，LuxR和信號分子結合后結構發生改變，可以結合到luxr、luxi基因中間的啟動子區，啟動下游luxab基因負責編碼的熒光素酶亞基基因的表達，同時抑制luxr基因的繼續表達，形成負反饋。

熒光素酶表達后催化費氏弧菌胞內的分子氧將長鏈的脂肪醛和還原態的黃素單核苷酸氧化為長鏈脂肪酸，同時釋放出最大發光強度波長位于450～490 nm的藍綠光。在海水中時，費氏弧菌的濃度較低，其周圍的信號分子濃度也較低，因此合成熒光素酶的基因關閉，細菌不發光；當費氏弧菌附著于魚類或烏賊等海洋生物上時，菌體密度達到一定的程度，熒光素酶基因被強力啟動，細菌發出熒光。在費氏弧菌的宿主夏威夷短尾魷魚上費氏弧菌可能達到109～1010個/cm3的細胞密度，費氏弧菌利用宿主體內豐富的營養物達到相當高的群落密度，發出的熒光又會為宿主吸引到獵物或者擺脫捕食者追捕，兩者借此互利共生[8]。

圖1 費氏弧菌群體感應系統 Fig.1 Quorum sensing system of Vibrio fischeri

1.2 銅綠假單胞菌的Las-Rhl群體感應系統

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一種常見的病原菌，屬于革蘭氏陰性，通過高絲氨酸內酯介導的QS系統調控其生命活動過程[9-10]，包括毒力因子的表達、生物膜的形成、抗生素排出泵的表達以及運動性等。銅綠假單胞菌群體感應系統如圖2所示。銅綠假單胞菌的群體感應系統是費氏弧菌群體感應系統研究的延伸，銅綠假單胞菌QS系統相關元件和費氏弧菌LuxI/R系統有顯著的同源性，但是銅綠假單胞菌的QS系統更為復雜。銅綠假單胞菌QS是一個復雜的層次網絡[11]，包含了Las和Rhl兩套QS系統，它們相互獨立又相互關聯。Las系統中[12-13]，lasi基因控制信號分子3OC12-HSL(PAI 1)的形成，信號分子合成后分泌到胞外環境，當累積到一定的濃度后會和LasR結合并激活大量毒力因子基因表達。包括：lasB、lasA、apr、toxA和lasI自身[14-17]，實驗證明缺失有活性的LasR蛋白的銅綠假單胞菌對動物無害。

Rhl系統中[18-19]，rhl催化N-butyryl-L-HSL(PAI2)的合成，該信號分子和RhlR結合后可以激活負責鼠李糖脂合成的rhlAB基因、負責信號分子蛋白合成的rhli基因和lasB基因的表達。Rhl系統也負責一些毒力因子表達[20-22]，包括綠膿菌素、氰化物和幾丁質等。這兩個系統之間存在級聯調控關系，Las系統控制轉錄激活蛋白RhlR的表達，因此Rhl系統控制的基因需要有完整且有活性的Las系統才能被完全激活[23-24]。兩種系統同時調節多種基因表達[15,22,25-28]，包括合成彈性蛋白酶、分泌蛋白、過氧化氫酶、外毒素、外凝集素、酰基高絲氨酸內酯和超氧化物歧化酶等多種毒力因子基因的表達。PAI Ⅰ會阻礙PAI Ⅱ和RhliR的結合，確保兩套系統分別在合適的時間運行[2]。

圖2 銅綠假單胞菌群體感應系統 Fig.2 Quorum sensing system of Pseudomonas aeruginosa

1.3 金黃色葡萄球菌的Agr群體感應系統

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種非常常見的人類致病菌，屬于革蘭氏陽性，金黃色葡萄球菌群體感應系統如圖3所示。它的Agr群體感應系統的核心agr操縱子包括一個編碼的自誘導肽(autoinducing peptides，AIPs) AgrD的基因agrD、一個負責編碼加工蛋白(AgrB)的基因agrB、一個編碼組氨酸激酶感應器(AgrC)的基因agrC和一個編碼反應調節器(AgrA)的基因agrA。AgrD是一種自誘導肽，負責QS系統的調控，在正常情況下保持較低的表達量，其可以被膜蛋白AgrB加工，截短成只保留活性肽段的AIP并不斷分泌到胞外，胞外的AIP濃度不斷增加最終達到臨界閾值后會被膜蛋白AgrC部分感知。然后AgrC膜蛋白會發生磷酸化，并將反應調控子AgrA磷酸化，磷酸化后的AgrA-P結合到agrABCD上游的啟動子區域，形成正反饋，啟動agrABCD基因和其他受Agr調控系統控制基因的表達[3]。

圖3 金黃色葡萄球菌群體感應系統 Fig.3 Quorum sensing system of Staphylococcus aureus

1.4 糞腸球菌的Fsr群體感應系統

糞腸球菌的群體感應系統為Fsr系統[29],如圖4所示。核心的fsr操縱子包含了fsrA、fsrB和fsrC3個基因，fsrA基因轉錄合成反饋調節肽FsrA，fsrB和fsrC一個編碼加工蛋白(FsrB)，一個編碼組氨酸激酶感應器(FsrC)，兩者共同構成一個操縱子。fsrB編碼的膜蛋白FsrB會加工Gelatinase biosynthesis activates pheromones(GBAP)并釋放到胞外。FsrC位于細胞膜上，可以協助GBAP進入細胞。糞腸球菌從指數期到穩定期的過程中，GBAP不斷積累，當GBAP濃度達到啟動子檢測閾值，處于fsr操縱子下游編碼白明膠酶和絲氨酸蛋白酶的gelE和sprE基因分別被誘導啟動。不同于Agr系統，Fsr系統的啟動是通過GBAP使FsrA發生磷酸化后直接和各個基因相對應的啟動子相結合，啟動下游基因的轉錄，而不涉及其他的信號分子的加工。相對的，當糞腸球菌數量較少，體系中的GBAP濃度低于一定的值時，FsrA會抑制fsrB-fsrC和gelE-sprE基因的表達。

圖4 糞腸球菌群體感應系統 Fig.4 Quorum sensing system of Enterococcus faecalis

2 群體感應系統的應用

2.1 利用群體感應系統調節代謝流

發酵工程菌負責合成大量重組蛋白，構建人工代謝通路，如果在培養起點就啟動蛋白表達會對菌體帶來巨大的負擔，使菌株無法達到良好的生長狀態。菌株的不良狀態會影響最終的產量[30]。因此，前人通過引入各式誘導表達調控系統實現轉錄水平的調控，其中以受IPTG誘導的T7表達系統應用最為廣泛。傳統的誘導表達調控系統有許多優點，包括能通過調節誘導劑濃度調節基因表達強度、通過控制誘導劑添加時間控制基因表達的啟動以平衡菌體的生長和產物的合成等。但是傳統的誘導表達調控系統也有許多缺點[31]，包括無法實現動態調控、對細胞狀態無法及時反饋等。另外，誘導劑價格不菲且對細胞有一定的毒性，這阻礙了其在工業化中的推廣[32]。

解決這一問題的方法之一就是在發酵菌株內引入動態代謝途徑調控系統來控制途徑基因的表達。已經有許多這方面的嘗試[33]。Farmerw等[34]通過在大腸桿菌體內構建一個乙酰磷酸的感應器調節番茄紅素的合成。Dahl等[35]在大腸桿菌中構建了一個感應有毒中間代謝產物焦磷酸法尼酯的壓力反饋感應器，使終產物青蒿素前體紫穗槐二烯產量提升了2倍，且避免了IPTG的添加。Soma等[36]通過在Plux啟動子中插入lacO操縱子構建了一個可以響應于IPTG濃度的雜合啟動子，實現了異丙醇生物合成的動態調控。有研究利用枯草芽孢桿菌中存的在丙二酰輔酶A調控系統設計了響應丙二酰輔酶A濃度的負反饋調節系統，提高了脂肪酸的產量[37-38]。

但是這些策略缺乏普適性，需要構建與產物途徑相關的感應器，無法應對復雜多變的產物需求，而群體感應系統可以通過感應范圍內菌濃度并啟動相應基因的表達，同時具有動態調節和通用性的優點。Williams等[39]在釀酒酵母中構建了一個高種群密度自動觸發表達的基因開關，并通過該策略提高了莽草酸途徑生產的對羥基苯甲酸的產量。Gupta等[40]利用Pantoeastewartii菌的群體感應系統構建了一個不依賴于代謝通路的基因控制元件，可以實現靶基因的動態調節，利用該元件篩選將糖分解代謝流重新分配到異源合成途徑中的最佳時間點，使肌醇的濃度提高了5.5倍，同時使葡萄糖二酸濃度從無法檢測提高到大于0.8 g/L，另外還將莽草酸的濃度從不可檢測提升到200 mg/L。Anand等[41]也證明利用QS系統可以用來輔助胞外酶的生產，細胞只有在在很高的臨界密度時胞外酶的產出才是占優勢的，利用QS系統控制胞外酶產生使得發酵菌株在起始密度低，生長周期比胞外酶產生時間長時更具優勢。基于群體感應的發酵工程動態調節結合發展迅速的合成生物學未來必將有更廣泛的空間。目前，利用群體感應進行有害微生物的防治具有更多的可能性以及現實性。

2.2 利用群體感應系統防治有害微生物

2.2.1 利用群體感應防止食品腐敗

食品腐敗是指食品在微生物作用下感官品質、營養品質以及衛生安全品質發生不良變化，喪失可食性的現象，每年食品腐敗都導致了巨大的經濟損失并且引起了嚴重的衛生安全問題[42]。研究表明特定微生物之間的QS在食品腐敗全程中均有參與，相關脂肪分解酶、蛋白分解酶的表達，生物膜的形成都與之相關。QS廣泛存在于各類食品腐敗過程中[43-45]，在牛奶、水果和蔬菜等各類腐敗食品中均檢測出了QS信號分子[46]，牛奶和奶制品的腐敗主要由假單胞菌和沙雷氏菌引起，肉制品的腐敗主要由蜂窩哈夫尼亞菌和沙雷氏菌引起，魚類和水產品的腐敗主要由腐敗希瓦氏菌和不動桿菌引起，果蔬的腐敗主要由歐文氏菌、假單胞菌和腸桿菌引起，針對這些微生物的群體感應調控參與的腐敗過程，研究人員希望通過抑制特定腐敗微生物的群體感應解決食品腐敗問題。

對于細菌群體感應的抑制和干擾主要有以下3種途徑[47]：抑制信號分子的合成、促進信號分子的降解和抑制信號分子與受體蛋白的結合，這些能夠抑制微生物的群體感應效應的物質稱為群體感應抑制劑(quorum sensing inhibitor，QSI)。目前QSI依據來源可分為天然提取和人工合成這兩類[47]。現今常用的人工合成的QSI，如鹵代呋喃酮及其衍生物雖有較強的干擾QS信號通路的活性，但是大多具有一定的毒性，有些QSI甚至可能誘變致癌，不適合應用于食品保鮮。考慮到食品安全問題，從食源性材料中提取QSI用于食品防腐是目前比較有效的方式。

Shobharani等[48]針對引起牛奶腐敗的假單胞菌，利用300 μmol/L濃度的二氫呋喃酮阻斷發酵牛奶中假單胞菌的信號交流，抑制了其毒力因子的產生，將貨架期延長到了9 d。Bai等[49]研究了孜然、姜黃、苦艾、延胡索、香肉豆蔻、葫蘆巴以及小豆蔻等香料精油對于酰化的高絲氨酸內酯介導的群體感應和生物膜形成的影響，發現在體積分數為0.02%時孜然精油具有最好的QS抑制效果和抗生物膜形成活性，亞抑菌濃度的孜然精油通過阻礙細胞接觸、降低細胞代謝和胞外聚合物產生抑制了假單胞菌的生物膜形成，延遲了冷凍牛奶中嗜冷性假單胞菌PSPF19引起的腐敗。

Chan等[50]從馬來西亞雨林的生姜根圍中分離出3株具有抑制群體感應效果的菌，分別鑒定為不動桿菌(GG2)，伯克霍爾德菌(GG4)和克雷柏氏桿菌屬(Se14)。GG2和Se14通過自身產生的內酯水解酶產生廣譜的AHL降解活力從而抑制群體感應，而GG4則通過酰基轉移酶改變AHL的結構實現群體感應的抑制。GG2和GG4也存在依賴于AHL的群體感應，它們產生的QSI對于自身的AHL以及外源的AHL均有抑制作用。實驗證明3株菌能有效減弱人和植物內的病原菌毒力因子的表達，且能有效抑制土豆塊莖中胡蘿卜軟腐歐文氏菌對于蛋白質的水解活性，延緩腐敗。

Truchado等[51]基于蜂蜜具有一定的抗菌活性這一研究結果，進一步探究了29種不同植物來源、不同地區的蜂蜜的群體感應抑制活性，發現測試蜂蜜在0.1 g/mL質量的濃度下就能夠抑制AHL的生成，其中栗子和椴科植物的蜂蜜具有不依賴于酚類的QS抑制活性，因此有望從蜂蜜中分離出安全且高效的QSI。

Vattem等[52]發現從可食用的水果、香草等植物中分離出的食用植物素對人體有益并具有抗菌活性，亞抑菌濃度的食用植物素可以同時干擾AHL活性以及抑制AHL的合成，兩種途徑相結合抑制群體感應，并且食用植物素還能抑制病原菌的聚集，可用于抗菌化學療法。

目前QSI在食品防腐中的應用方興未艾，更多研究者將目光聚焦于將群體感應運用于新型醫療手段的開發。

2.2.2 利用群體感應系統防治致病菌

抗生素因其強大的抗菌能力而被廣泛應用于醫學醫藥領域，然而，抗生素的濫用也漸漸導致越來越多新型耐藥性致病菌的出現。抗生素漸漸變得低效[53]。

銅綠假單胞菌極易導致免疫力低下患者的感染[54-55]，呼吸道囊性纖維化患者、外傷燒傷患者或者需要通風的創傷患者都易感染銅綠假單胞菌并引發嚴重后果，在治療過程中大量使用抗生素導致耐藥性銅綠假單胞菌的出現[56]。

根據美國疾病控制中心報告，在眾多人類致病菌中，由金黃色葡萄球菌引起的感染居第二位，金黃色葡萄球菌感染已經屬于世界性的衛生問題[57]，其高度的適應性和傳播性使得它更易產生耐藥性突變，多耐藥性金黃色葡萄球菌檢出率不斷增高[58]。這兩種菌的致病性基因的表達都受到QS系統的監管調節，研究人員嘗試通過QSI設計新型治療方案，減少對致病菌施加的選擇生存壓力，減少耐藥性菌株的出現。

新加坡南洋理工大學的Ling等[59]發現銅綠假單胞菌PAO1可以編碼一種新型的S型綠膿桿菌素pyocin S5，對于7株臨床分離的銅綠假單胞菌具有抗菌活性。Saeidi等[60]基于這個發現，構建了一株能檢測致病性銅綠假單胞菌并通過釋放pyocin S5裂解殺滅致病菌的工程大腸桿菌，他們在大腸桿菌體內導入組成型表達的銅綠假單胞菌QS系統受體蛋白基因lasr、受銅綠假單胞菌QS調控表達的綠膿桿菌素基因PyocinS5以及細胞溶解酶基因LysisE7。大腸桿菌感應到體系內的銅綠假單胞菌QS信號分子后會啟動下游基因的表達，生成可破壞銅綠假單胞菌細胞膜而對大腸桿菌無效的pyocin S5，殺死體系內的銅綠假單胞菌并將細胞溶解。結果顯示該基因工程菌能降低生物膜的厚度，檢測并殺死99%浮游的銅綠假單胞菌。

Hwang等[61]針對被生物膜包被的銅綠假單胞菌，在此基礎上引入了趨藥性基因CheZ，使大腸桿菌能自發富集到銅綠假單胞菌AHL信號分子濃度較高的區域，再利用抗菌肽MccS和抗生物膜酶DNase1，達到同時殺滅浮游的銅綠假單胞菌和生物膜包被的銅綠假單胞菌的目的。

Loughlin等[62]研究了一種人工合成的群體感應抑制劑mBTL，可以抑制銅綠假單胞菌的毒力因子綠膿桿菌素和生物被膜形成。mBTL主要作用于銅綠假單胞菌的兩個QS受體蛋白LasR和RhlR，具有和信號分子相似的結構，可以通過與受體蛋白的競爭結合，抑制受QS調控的相關基因的表達，8 μmol/L的濃度即可綠膿桿菌素生產，且經實驗證明在體內體外均能有效。

Srivastava等[63]發現從母馬初乳中提取的多聚己糖具有抑制金黃色葡萄球菌QS的功效，可以抑制金黃色葡萄球菌毒力因子的表達，同時增加了其對抗生素的敏感性。

Cosgriff等[3]在對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的毒力因子篩查過程中發現了一個膜內嵌的肽酶基因(MroQ)，缺失該基因的金黃色葡萄球菌顯著降低了AIPs的分泌，受QS調控的一系列毒力因子表達也因此變弱，這個發現為利用QS系統建立安全的金黃色葡萄球菌感染治療方案提供了新的思路。

4 群體感應系統的應用與展望

群體感應系統的深入研究為發酵工程動態調控、有害微生物防治等提供了新的思路，但是目前的研究依然存在一些不足或尚未明晰之處。目前群體感應的復雜多層次的調控網絡還未能完全解析清楚，不同調控系統之間是否可以互相干擾也需要進一步的探究；基于群體感應的動態調控存在一定的滲漏，無法對靶基因的表達實現嚴謹調控，且基因表達的啟動是不可逆的。需要對以群體感應為基礎的基因元件進一步優化改造以及發現更加優秀的群體感應調節元件，努力使發酵過程更加簡化，成本更加低廉，控制更加精密，向產業化方向靠攏；以QSI為基礎的食品防腐劑目前的應用局限性在于從植物中提取的含量有限，而天然合成的QSI在食品安全性上很難得到保障，對于QSI的探索還需要充分考慮其應用的安全性及穩定性。