CyclinD2、BCL-2、Survivin在彌漫大 B 細胞淋巴瘤中的表達及意義

孔偉梁，王俊，周斐

（長興縣中醫院，浙江 長興 313100）

彌漫大B細胞淋巴瘤是成人淋巴瘤最常見的類型，在組織形態、臨床表現及預后等方面有著較高的異質性，其病情進展快速，未經及時治療者的中位生存期極低[1-2]。近年來的研究證實，惡性腫瘤的發生常伴增殖促進因子和凋亡抑制因子的異常表達[3]。CyclinD2作為一種細胞周期蛋白，參與細胞周期的調控，在多種腫瘤中呈異常表達[4]。BCL-2蛋白為最新發現的凋亡抑制基因，可通過線粒體自穩作用影響細胞色素C的分泌，抑制細胞凋亡，且可阻斷化療所致腫瘤細胞的凋亡途徑，降低臨床療效[5]。Survivin為腫瘤特異性抗原，與惡性腫瘤的發生發展、放化療敏感性及預后有著良好的相關性[6]。本研究旨在探討CyclinD2、BCL-2、Survivin在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達，為個體化治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2011年3月-2014年3月收治的89例彌漫大B細胞淋巴瘤患者。入選標準[7]：（1）均符合彌漫大B細胞淋巴瘤診斷標準：淋巴結迅速增大，可伴進行性消瘦、盜汗、發熱等全身表現，形態學提示淋巴細胞體積較大，細胞漿豐富，核呈卵圓形或圓形，核仁突出，并經組織病理學確診；（2）均接受3個療程以上的規范放化療。排除標準：（1）凝血及肝腎功能明顯異常；（2）生存期預計＜3個月；（3）伴其他惡性腫瘤。89例中男55例，女34例；年齡22-73歲，平均（60.3±7.7）歲。 同期選擇 25例良性反應性增生淋巴組織作為對照組，男15例，女10例，年齡 21-75歲，平均（61.8±6.6）歲。 兩組年齡、性別比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法 收集淋巴組織，放置于液氮中并轉移至-80℃低溫箱中待用。選用免疫組織化學染色法進行測定，石蠟標本進行4μm層厚連續切片，放置在70℃烤箱中烘烤1.5小時。將切片進行二甲苯脫蠟，并予以100%、90%、80%、70%的梯度酒精水化。于蒸餾水中漂洗3分鐘，以磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗3次。在切片中加入3%H2O2去離子水孵育10分鐘，抑制內源性過氧化物酶活性。以PBS沖洗3次，參照各抗體要求進行相應的熱抗原修復，PBS沖洗3次。于切片中加入稀釋一抗，放置于4℃冰箱中過夜。以PBS沖洗3次，加入通用性IgG抗體-HRP多聚體，室溫環境下放置30分鐘。以PBS沖洗3次，于每個切片中加入2滴剛配制的濃縮型3，3-二氨基聯苯胺（DAB）溶液進行顯色，在顯微鏡下調控顯色時間至陽性物質出現棕黃色反應時，用自來水沖洗并終止顯色反應。取蘇木素進行復染，以自來水再次返藍，梯度酒精以脫水干燥，用中性樹脂進行封片。

1.3 觀察指標 （1）陽性細胞比例。在高倍鏡（400倍）下隨機選擇5個視野，單個視野觀察細胞200個以上。CyclinD2陽性表達在細胞核，BCL-2、Survivin陽性表達在細胞核及細胞質，顏色為黃色或棕色顆粒。陽性細胞比例在10%以上判定為陽性[8]。（2）5年生存率。以門診復診、電話等方式進行為期5年的隨訪，統計5年生存率。

1.4 統計學處理 采用SPSS18.0軟件統計學處理，計量資料用（±s）表示，并采用獨立樣本t檢驗，計數資料采用百分率表示，比較用χ2檢驗。

2 結果

2.1 CyclinD2、BCL-2、Survivin表達 彌漫大B細胞淋巴瘤組織中CyclinD2、BCL-2、Survivin的陽性表達率均高于反應性增生淋巴組織，差異具有統計學意義（P＜0.05），詳見表 1。

表 1 兩組 CyclinD2、BCL-2、Survivin的表達比較[n（%）]

2.2 臨床病理特征 CyclinD2、BCL-2、Survivin表達和彌漫大B細胞淋巴瘤的年齡、性別、部位、組織類型、分化程度無關（均P>0.05）；和Ann Arbor分期、免疫分型、IPI指數、首次治療療效有關（均P<0.05），詳見表 2。

表2 CyclinD2、BCL-2、Survivin在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達和臨床病理特征的關系（n）

3 討論

彌漫大B細胞淋巴瘤為非霍奇金淋巴瘤的常見亞型之一，多在老年人群中發病，臨床以“快速增大的無痛性腫塊”為典型癥狀，也可引起程度不一的鼻出血、吞咽困難等表現，預后多不理想[9]。近年來，彌漫大B細胞淋巴瘤的生物學研究在臨床上體現出一定價值，不僅利于疾病診斷，且可預測治療效果、評估預后[10]。細胞周期蛋白可隨著細胞周期變化而相應改變，CyclinD2為其常見亞型，是誘導致癌信號及有絲分裂的最終受體，在細胞周期調控中發揮關鍵作用[11]。CyclinD2能夠激活相應的細胞周期蛋白依賴性激酶，形成復合物，并誘導RB磷酸化失活，促進E2F基因表達上調，參與DNA合成[12]。多種致癌因素可導致CyclinD2調控基因和產物異常，引起細胞周期失控，促進細胞的無限增殖，利于細胞惡性轉化及腫瘤形成[13]。CyclinD2可在多種惡性腫瘤中的異常表達，并參與腫瘤發病[14-15]。本研究顯示，彌漫大B細胞淋巴瘤組織CyclinD2陽性表達率高于反應性增生淋巴組織組，但陽性表達率僅為34.83%，考慮與CyclinD2基因啟動區域存在甲基化，從而影響蛋白表達有關，進一步分析其與臨床病理特征的關系發現，CyclinD2表達在不同Ann Arbor分期、免疫分型、IPI指數、首次治療療效中差異有統計學意義（P＜0.05），說明通過測定其表達情況不僅能夠鑒別疾病的良惡性，也可反映腫瘤的生物學行為，從而用于評估療效。

BCL-2為凋亡抑制基因，主要于細胞中線粒體核膜、外膜及粗面內質網上表達，其過度表達可抑制多種因素所致的細胞凋亡，延長細胞壽命，促進細胞生化。有關研究發現，多種凋亡細胞中其表達明顯下降[16-17]。糜公仆等[18]的研究指出，BCL-2過度表達能夠明顯抑制細胞株凋亡，并指出其可經調控組織細胞凋亡導致組織中凋亡及增殖失衡，從而引發疾病。本研究中，彌漫大B細胞淋巴瘤組BCL-2陽性表達率為62.92%，反應性增生淋巴組織組僅為 8%，兩者差異顯著（P＜0.01），與楊海燕等[19]報道相似，且和Ann Arbor分期、免疫分型、IPI指數、首次治療療效有關（均P<0.05）。

Survivin為最新發現的IAPs物質，主要功能是抑制細胞凋亡，通過特征性BIR區和細胞凋亡期間的下游Caspase-3結合為復合物，減弱Capase-3催化活性，從而影響腫瘤細胞凋亡及壞死[20]。大部分惡性腫瘤中均可發現Survivin異常表達，且和腫瘤耐藥及預后相關[21]。已有研究認為，Survivin在結直腸癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中過表達說明預后不良，但其在淋巴瘤中的表達尚存爭議[22]。本文結果顯示，Survivin在彌漫大B細胞淋巴瘤組織中的陽性表達率明顯上升，達77.53%，說明Survivin可能參與疾病的發生發展，且其在Ⅲ-ⅣAnn Arbor分期、GCB型、高IPI指數及首次療效為未完全緩解中的表達相對較高，說明Survivin可能與彌漫大B細胞淋巴瘤的惡性程度有關，有望成為評估疾病進展及預后的新型標志物。

綜上所述，CyclinD2、BCL-2、Survivin 在彌漫大B細胞淋巴瘤患者中呈高表達，可作為生物惡性程度、療效評價的參考指標。