特立帕肽聯合阿托伐他汀用于糖尿病性骨質疏松大鼠的藥效學及藥代動力學研究

周杰 ，陳博

（1.永康市第二人民醫院，浙江 永康 321307；2.浙江大學醫學院附屬第一醫院，浙江 杭州 310003）

糖尿病性骨質疏松（diabetic osteoporosis，DOP）是骨骼系統中常見的糖尿病并發癥。糖尿病患者中高達60%會出現DOP，糖尿病已經成為骨質疏松癥發生發展的一個重要因素[1]。目前對于DOP的治療，臨床上仍以抗骨質疏松藥物治療為主。由于有限的療效和不良反應，探索新的藥物作用靶點及用藥方案受到了廣泛的重視。有研究表明，他汀類藥物可以通過降脂和促進骨形成的雙重作用減少高血糖對骨代謝的影響，以此來治療骨質疏松癥[2]。然而，他汀類藥物用于增強骨形成的使用劑量會高于降血脂所需的劑量，高劑量的他汀類藥物會引起不良反應。因此，聯合用藥成為臨床上解決此問題的一個重要方法。特立帕肽即重組人內源性甲狀旁腺激素活性片段（1-34），是臨床上較常用的治療骨質疏松癥的藥物，尤其對絕經后骨質疏松具有非常好的療效[3-4]。然而，對DOP的治療因缺乏針對性、高經濟負擔和每日皮下注射的不方便亦限制了其廣泛應用。因此，本研究探討兩者聯合使用治療糖尿病骨質疏松的合理性、有效性及安全性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 （1）實驗儀器。雙能X線骨密度檢測儀 （法國，Medilink公司）；Agilent 1290 HPLC高效液相色譜儀 （德國，Agilent Technologies公司）；Agilent 6420串聯三重四極桿質譜儀 （德國，Agilent Technologies公司）；1470 Wizard型放免γ測量儀（美國，Perkin Elmer）；Eppendorf AG 5430R 低溫高速離心機（德國，Eppendorf公司）；TC-Meteor 7.2K 型多管漩渦混合儀 （寧波，topscien instrument公司）；EFAA-DC24-RT型氮吹濃縮裝置（上海，安譜實驗科技股份有限公司）。大鼠I型原膠原N端前肽PINPELISA試劑盒（北京科瑞美科技有限公司）。甲醇、乙腈為質譜純（美國默克公司）；雙蒸水（Milli-Q系統純化水）；其他試劑均為分析純級別；（2）實驗動物。8周齡SPF級健康雄性SD大鼠50只（合格證號：NO.201727217），體質量 180~190g，購自上海必凱實驗動物中心。動物飼養于SPF級動物實驗中心，飼養室溫（20±2）℃，濕度（60±10）%，自然晝夜節律光照（12小時/12小時），自由攝取水和食物，飼料購自南京協同生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模[5]大鼠適應性飼養7天后隨機取10只作為正常組以飼料維持常規喂養；剩余40只作為模型組以高糖高脂飼料（配方：常規飼料、20%的蔗糖、15%熟豬油、1.5%膽固醇）喂養2周。所有實驗動物按60mg/（kg·d）劑量腹腔注射含0.2%脲佐菌素（美國Sigma公司）的0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH值4.5）連續給藥1周。模型組持續高脂高糖飼料喂養6周，測大鼠尾靜脈血糖，空腹血糖＞16.7mmol/L認為糖尿病模型造模成功；雙能X線檢測大鼠骨密度，并測血磷及血鈣。造模成功的實驗動物隨機分為對照組、阿托伐他汀組、特立帕肽組及聯合組，每組各10只。

1.2.2 給藥方法 正常組與對照組給予0.05%羧甲基纖維素鈉 2mL/（kg·d）灌胃；阿托伐他汀組給予阿托伐他汀 10mg/（kg·d）（輝瑞制藥有限公司） 灌胃；特立帕肽組皮下注射特立帕肽 4μg/（kg·d）（美國禮來公司）；聯合組給予10mg/kg阿托伐他汀灌胃同時皮下注射4μg/kg特立帕肽。以上四組均連續給藥12周。

1.2.3 特立帕肽及阿托伐他汀藥代動力學研究

1.2.3.1 取血 分組后第一次給藥前5分鐘，給藥后5、15、30、60、120、240、480、720 分 鐘 尾 靜 脈 取 血200μL置于含肝素鈉抗凝的試管中，4℃3000r/min離心10分鐘取上清血漿，置-80℃保存待測。

1.2.3.2 特立帕肽血藥濃度檢測[6]（1）血漿樣品處理SPE固相萃取小柱加1mL 50%乙醇（含0.1%三氟乙酸）活化；取血漿樣本100μL于小柱內，加1mL去離子水淋洗；然后用60%乙醇（含0.1%三氟乙酸水）溶液洗脫，洗脫液于冷凍干燥器濃縮干燥，測定時用緩沖液稀釋到合適的濃度。（2）標準溶液制備。取rhPTH（1-34）標準品，用去離子水配制濃度分別為 5、2、50、100、500ng/mL 的標準品溶液。質控樣本（QC）配制含 rhPTH（1-34）標準品濃度為5、50、400ng/mL三種標準溶液，分裝于離心管中，-80℃保存待測。（3）特立帕肽血藥濃度檢測取200μL血漿處理液加入ELISA TUBES管中，分別加入100μL 125I-anti PTH振蕩3分鐘，25℃ 孵育20小時，棄上清液，加3mL吐溫20，靜置5分鐘后棄去上清液，重復洗滌3次，γ-count測計數。

1.2.3.3 阿托伐他汀血藥濃度檢測 （1）使用Agilent Technologies 1290高效液相色譜系統結合ShimackGVP-ODS（2.0mm×5mm，2.2μm）對樣品進行分離，流動相采用 5mM 甲酸銨 pH 5.5（A）-乙腈（B），以梯度洗脫：0~2分鐘:10%B；2~4分鐘:10%~90%B；4~4.5分鐘:80%~95%B；再接5.5分鐘的柱平衡。流速 0.30mL/min；進樣體積為 10μL。（2）使用配備有電噴霧電離源的Agilent Technologies 6420三重四極質譜儀進行質譜檢測，以單位質量分辨率和100ms的停留時間在多反應監測模式下進行檢測。表1為優化的質譜參數。HPLC和MS的所有參數由安捷倫科技公司購買的定性分析B.06.00軟件控制。（3）溶液制備精密稱取阿托伐他汀鈣2mg，置于2mL容量瓶中，用色譜甲醇稀釋至刻度，配制成1mg/mL的標準儲備液，置4℃冰箱保存。稱取地西泮2mg置于2mL容量瓶中，用色譜甲醇配制成1mg/mL的標準儲備液，置4℃冰箱保存。（4）將血漿樣品100μL加入到5mL EP管中，同時加入25μL地西泮溶液。渦旋30秒，加入300μL 0.5M甲酸銨緩沖溶液（pH4.2），渦旋30秒，再加入3.0mL甲基叔丁基醚（MTBE），渦旋5分鐘，于5000rpm/min轉速下離心10分鐘。分離有機層，氮氣吹干（37℃），用200μL初始流動相復溶，4℃ 12000r/min離心10分鐘取上清液，進樣10μL。

表1 多反應監測LC-MS/MS優化的質譜參數

1.2.4 藥效學評價 各組均于給藥治療12周最后一次給藥后隔夜禁食12小時，次日清晨采血、離心、取血清，檢測空腹血糖、胰島素、血鈣、血磷、堿性磷酸酶、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、I型原膠原N端前肽（PINP）及胰島素樣生長因子（IGF-1）表達水平。應用雙能X線骨密度儀及小動物骨密度檢測分析軟件，處死前進行全身骨密度測量，測量參數為雙能電壓40kVp和100kVp，掃描窗寬20cm，掃描速率5s/cm。

2 結果

2.1 藥效學評價 10項指標（空腹血糖、胰島素、TG、TC、血鈣、血磷、堿性磷酸酶、BMD、PINP、IGF-1），模型組與正常組比較差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），其中空腹血糖、TG、TC、堿性磷酸酶降低，其余升高，說明高糖高血脂、低鈣低骨密度的糖尿病骨質疏松動物模型建模成功。但經過阿托伐他汀、特立帕肽及兩者聯合用藥后發現，與對照組比較，阿托伐他汀組10個指標中只有血鈣沒有改善，而特立帕肽組中空腹血糖、胰島素和TG、TC均無改善，聯合組10個指標均有改善。進而對阿托伐他汀組、特立帕肽組和聯合組進行比較發現，聯合組在改善空腹血糖、胰島素和TG、TC方面與阿托伐他汀組差異無統計學意義（P＞0.05），其他6個指標，均為聯合組更有效；特立帕肽組10個指標的改善均不及聯合組，差異具有統計學意義（均P＜0.01）。 詳見表 2。

表2 各組藥效學評價（±s）

表2 各組藥效學評價（±s）

組別 n 空腹血糖（mmol/L） 胰島素（mmol/L） TG（mg/dL） TC（mg/dL） 血鈣（mmol/L）正常組 10 6.08±0.79** 21.16±2.05** 42.38±3.19** 55.28±4.61** 2.97±0.41*對照組 10 22.39±2.15 10.09±0.88 106.24±4.11 84.36±3.97 1.97±0.21阿托伐他汀組 10 13.89±1.97** 16.21±1.29** 79.93±4.71** 66.83±2.79** 2.01±0.11△特立帕肽組 10 20.79±1.77△ 11.02±3.01△ 106.93±8.82△ 85.18±5.22△ 2.66±0.21**△聯合組 10 14.07±2.01** 16.96±2.11** 80.52±5.21** 67.69±7.11** 2.79±0.13**

續表2

2.2 藥代動力學

2.2.1 阿托伐他汀 根據美國食品和藥物管理局工業生物分析方法驗證指南（美國食品和藥物管理局，2001年）對該方法的特異性、線性、精密度、準確度、回收率、基質效應和穩定性進行了充分驗證。將空白血漿、標準血漿樣品及給藥后血漿樣品色譜圖進行比較，未觀察到內源峰的干擾，表明具有良好的特異性；阿托伐他汀在0.5~3000ng/L濃度范圍內線性良好（r2>0.995）；定量下限為0.5ng/L，其中準確度RSD在±20%內，并且精密度RSD<20%；準確度RSD在±15%內，精密度RSD＜15%，均符合指導原則的要求。提取回收率大于85%，精密度RSD均＜15%，重現性好；血漿樣品反復凍融循環中、-80℃保存28天及處理后樣品進樣器短期放置6小時未觀察到明顯的降解（RSD<15%），表明穩定性良好。

2.2.2 特立帕肽 該方法在特立帕肽5~400ng/L范圍內線性關系良好：Y=-0.0039X2+20.376X （R2=0.998）；由三個濃度質控樣本3天連續測定三批次樣本，每批次設五個重復，計算日內、日間精密度及準確度RSD±15%；由三個濃度質控樣本，每個濃度設五個重復，檢測提取回收率均大于80%，重復性良好且方法穩定。

2.2.3 藥代動力學評價 阿托伐他汀組與聯合組的藥代動力學參數相比，血藥峰濃度Cmax時曲線下面積AUC0-t與 AUC0-∞ 略有增大（P<0.05）；特立帕肽組與聯合組的藥代動力學參數比較略有改變，但差異無統計學意義（P>0.05）。詳見表3

表3 聯合用藥與非聯合用藥后阿托伐他汀和特立帕肽的藥代動力學參數比較（±s）

表3 聯合用藥與非聯合用藥后阿托伐他汀和特立帕肽的藥代動力學參數比較（±s）

注：AUC為藥時曲線下面積；CL/F為表觀血漿清除率；Cmax為血漿峰濃度；Tmax為達峰時間與阿托伐他汀組比較*P<0.05

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3 討論

糖尿病患者高發骨質疏松癥主要是因為胰島素缺乏及胰島素抵抗抑制了成骨細胞形成，并抑制成骨細胞代謝，使IGF-1減少；同時高血糖不僅導致骨礦鈣質異常沉積，還會引起滲透性利尿，導致磷離子、鈣離子等的排泄量增加，再吸收減少，而人體內磷、鈣等離子的代謝平衡狀態與骨密度關系密切[7-8]。

阿托伐他汀屬于他汀類降脂藥物，能夠抑制膽固醇合成，競爭性抑制羥甲基戊二酰輔酶A還原酶，從而降低總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇及甘油三酯等[9]，多用于治療高脂血癥[10]。近年的研究發現，他汀類藥物具有促進骨再生的作用，對骨質疏松癥骨折的防治有巨大的潛力[11]，其可通過上調骨形成蛋白，促進成骨細胞形成，降低成骨細胞凋亡而增加骨生成。他汀類藥物應用于骨質疏松疾病治療所用劑量明顯高于降脂降糖功效時的劑量，故其安全性問題限制了該類藥物的應用。特立帕肽為基因重組的人類甲狀旁腺激素片段，對于絕經期骨質疏松的治療具有非常好的效果，可以通過促進成骨細胞增殖和分化抑制其凋亡[12]，刺激并促進骨形成，但在改善糖尿病骨質疏松中的報道不多，因此，本實驗通過建立糖尿病性骨質疏松大鼠模型。探討通過聯合應用兩種藥物降低阿托伐他汀的用藥劑量從而降低不良反應的發生，及對其治療糖尿病性骨質疏松癥的效果，結果顯示，對照組較正常組10個指標（空腹血糖、胰島素、TG、TC、血鈣、血磷、堿性磷酸酶、BMD、PINP及IGF-1）差異均有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），表明該模型具有骨質疏松癥特征，建模成功。實驗結果進一步表明，經過阿托伐他汀、特立帕肽及兩者聯合用藥后發現，與對照組比較，阿托伐他汀組10個指標中只有血鈣沒有改善，而特立帕肽組中空腹血糖、胰島素和TG、TC均無改善，聯合組10個指標均有改善。進而對阿托伐他汀組、特立帕肽組和聯合組進行比較發現，聯合組在改善空腹血糖、胰島素和TG、TC方面與阿托伐他汀組不相上下，差異無統計學意義（P＞0.05），表明特立帕肽不影響阿托伐他汀在降血糖及降血脂方面的藥效，其他6個指標均為聯合組更有效，而動物體內血磷、血鈣及骨密度明顯提高并且顯著改變模型大鼠體內PINP和IGF-1水平，表明特立帕肽顯著提高了阿托伐他汀改善骨質疏松癥狀方面的療效，兩藥共同發揮了促進成骨、抑制破骨的功能有關。特立帕肽組10個指標的改善均不及聯合組，差異具有統計學意義（均P＜0.01）。因此，兩藥聯合對治療糖尿病性骨質疏松癥具有相互促進作用，特立帕肽的使用降低了阿托伐他汀的給藥劑量，即降低了其毒副作用，同時藥效不會減弱，對治療糖尿病性骨質疏松癥有效。

他汀類藥物多在肝臟中通過CYP450酶系代謝失活從而排出體外[13]。許多物質對CYP450具有潛在的抑制作用，因此可以改變他汀類藥物的代謝動力學產生嚴重的毒副作用。為了明確特立帕肽與阿托伐他汀共同應用于糖尿病性骨質疏松癥時是否可能發生毒副作用，本文建立了精密、穩定、可信的HPLC-MS/MS方法檢測大鼠血漿中阿托伐他汀及特立帕肽濃度，對比聯合給藥與單獨給藥時血藥濃度的變化。實驗結果顯示，特立帕肽與阿托伐他汀鈣聯用前后，特立帕肽代謝動力學參數未發生顯著性差異（P>0.05），表明阿托伐他汀不干擾特立帕肽在動物體內的吸收及代謝，兩藥聯用時特立帕肽不會產生由血藥濃度改變引發的毒副反應，而阿托伐他汀鈣血藥濃度略有增高（P<0.05），可能是特立帕肽抑制了他汀類藥物代謝的關鍵酶CYP3A4，從而抑制了阿托伐他汀鈣在糖尿病性骨質疏松癥大鼠體內的代謝，導致血藥濃度上升。該結果表明，兩藥聯用時可適當降低阿托伐他汀的使用劑量，在不改變其治療效果的基礎上降低阿托伐他汀的血藥濃度，避免毒副反應的發生。

綜上，特立帕肽聯合阿托伐他汀用于糖尿病性骨質疏松癥可有效改善骨代謝、明顯增加骨密度，其效果優于單用阿托伐他汀或特立帕肽。兩者聯合使用可能成為治療糖尿病性骨質疏松癥的可選給藥方案。聯合用藥時應適當降低阿托伐他汀的用藥劑量，以降低藥物不良反應的發生風險。但這僅僅是動物實驗，在臨床應用中是否會出現與動物實驗一致的結果仍需進一步研究。