Claudin-14在納米細菌腎結石形成中表達的動態研究

申茂磊，王勤章，錢 成，徐 浩，郝志強，李 鵬，錢 彪

(1.新疆維吾爾自治區石河子大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科，新疆石河子 832000；2.解放軍69235部隊，新疆奎屯 833200)

有研究顯示，納米細菌可能是引起泌尿系結石的因素之一，在泌尿系結石的發病當中扮演著重要的角色[1-2]。SHIEKH等[3]認為，納米細菌可通過誘發腎臟發生慢性炎癥反應進而引起腎臟腎小管上皮細胞損傷鈣化，提示納米細菌引起的結石可能是含鈣結石。泌尿系結石是由多種因素相互作用所導致的，而尿液中的游離鈣增高與泌尿系含鈣結石形成有重要關系[4-5]。研究表明，緊密連接蛋白-14(Claudin-14)的表達增強可抑制腎小管對鈣離子的重吸收，從而導致高鈣尿，影響結石的形成[6-7]。本課題組推測Claudin-14表達異常可能是納米細菌引起結石的原因之一，通過注射納米細菌，連續10周動態檢測Wistar雄性大鼠腎臟Claudin-14的表達情況，初步探討Claudin-14在納米細菌形成結石中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料無特定病原體動物(specific pathogen free，SPF)級雄性Wistar大鼠60只，6周齡左右，體質量(210±15)g，購自新疆醫科大學實驗動物中心[合格證號SCXK(新)2013-0001]。用B超等方法確診的患者尿液培養而來的納米細菌懸濁液，多功能光學顯微鏡及圖像采集系統(BX40，日本Olympus公司)，Claudin-14抗體(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠腎結石模型建立及實驗取材 參照褚浩等[8]的方法制作大鼠腎結石模型。60只SPF級Wistar雄性大鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字列表法分為2組，即對照組和納米細菌組，每組30只。對照組的大鼠一次性給予尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液1.2 mL，納米細菌組大鼠一次性給予尾靜脈注射納米細菌懸濁液1.2 mL。兩組Wistar雄性大鼠注射后的1～10周每周處死3只，收集左右雙側腎臟待測。

1.2.2病理學檢查 水合氯醛麻醉處死實驗大鼠，手術切取雙側腎，兩側腎臟各取一部分用甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片行常規蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，普通光學顯微鏡下觀察腎組織形態學變化及腎小管區有無結石結晶，以判斷腎結石模型是否成功建立。按照安瑞華等[9]提供的判定腎臟結石標準進行統計：0級判為陰性結果；Ⅰ～Ⅳ級判為陽性結果；若雙側腎臟同時出現陽性結果時，僅計1次。統計1～10周后兩組Wistar雄性大鼠腎臟晶體顆粒陽性情況。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測Clanudin-14mRNA表達 獲取大鼠腎臟組織后，在超凈臺下剪取約100 mg腎臟組織，放置于1.5 mL無酶離心管中；經Trizol裂解以及3次4 ℃高速離心后，冰上空干，加入20 μL焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水，利用核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度并配平，以cDNA為模版按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，放入-20 ℃冰箱中備用， PCR反應采用20 μL體系，反應條件95 ℃×1 min,預變性，95 ℃×15 s，60 ℃×30 s，72 ℃×30 s，一共40個循環。每個樣品重復3次進行定量。結果用3次測定平均Ct值來表示。所用引物序列見表1。

1.2.4免疫組化檢測Clanudin-14蛋白表達 取病理鑒定模型成功的另一部分腎臟用于做免疫組化。免疫組化采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(streptavidin-perosidase，SP)法，石蠟包埋后切片4 μm，常規脫蠟， H2O2處理清除內源性過氧化物酶，枸緣酸緩沖液抗原修復，血清封閉。滴加Clanudin-14抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜，滴加二抗，二氨基聯苯胺(dimoinobenzidine，DAB)顯微鏡下控制顯色，蘇木素復染，不同濃度乙醇和二甲苯脫水，樹膠封片，顯微鏡下觀察1～10周兩組Wistar雄性大鼠腎臟Clanudin-14免疫組織化學染色情況。

表1用PrimerPremier5.0軟件設計引物，內參、緊密連接蛋白-14引物序列

基因引物序列內參上游序列CAACCTTCTTGCAGCTCCTC下游序列CGGTGTCCCTTCTGAGTGTT緊密連接蛋白-14上游序列CTCTGCATGGTGGCTGTCT下游序列GGAGATGAAGCCGAGGTACA

1.3統計學方法采用SPSS22.0統計學軟件進行數據分析。計數資料比較采用兩獨立樣本比較的Wilcoxon符號秩和檢驗，計量資料采用均數加減標準差表示，兩組間比較用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1病理組織學檢查1～3周納米細菌組未發現晶體顆粒沉積，第4周以后納米細菌組Wistar雄性大鼠腎小管內發現晶體顆粒沉積，且主要分布于近、遠曲小管，晶體顆粒大多呈零星散在分布，少部分晶體互相連接成片狀分布。第1～10周，對照組Wistar雄性大鼠腎臟內未見晶體顆粒沉積(圖1)。1～10周，納米細菌組Wistar雄性大鼠腎臟晶體顆粒陽性11只(50%)，因納米細菌組Wistar雄性大鼠在第4周開始成石，而前3周已處死的Wistar雄性大鼠也存在結石的可能，所以在計算成石率時將前兩周已處死的大鼠排除在大鼠總計數之外，對照組均為陰性。納米細菌組Wistar雄性大鼠腎臟晶體顆粒陽性率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.001，表2)。

表2兩組Wistar雄性大鼠腎組織結晶分級(例)

組別n0ⅠⅡⅢⅣ成石率(%)納米細菌組2211641050對照組303000000

納米細菌組與對照組相比，P<0.05。

圖1兩組Wistar雄性大鼠第8周腎臟組織HE染色圖(HE，×100)

A：對照組；B：納米細菌組。

2.2qRT-PCR檢測腎組織Clanudin-14mRNA表達結果第1～3周Claudin-14 mRNA在納米細菌組中幾乎未見表達，第4～10周納米細菌組中Claudin-14 mRNA表達量增多并且較對照組明顯增多(P<0.05，圖2)。

2.3腎組織Clandin-14蛋白免疫組化檢查結果由2位病理科老師共同鑒定。普通光學顯微鏡下可觀察顯示：1～3周Claudin-14蛋白在納米細菌組中幾乎未見表達，從第4周起納米細菌組中Claudin-14表達強度逐漸增強并且表達強度較對照組增高，同樣呈棕褐色集中分布在腎小管上皮細胞的細胞膜上，1～10周Claudin-14在對照組中幾乎未見表達(圖3)。

圖2 兩組Wistar雄性大鼠腎臟組織Claudin-14mRNA的表達

3 討 論

泌尿系結石是泌尿外科住院患者中最常見的病因，其中腎結石是最常見的病因之一。腎結石發病率及流行率在世界范圍內有增加的趨勢，有研究顯示可能與肥胖、Randall斑塊、骨橋蛋白、性別、年齡、種族密切相關[10-14]，但其發病機制仍不明確。大量研究顯示納米細菌在泌尿系結石形成中扮演重要的角色[15-19]。納米細菌是KAJANDER等[20]在調查牛血清培養失敗時偶然發現的，在特殊的培養條件下，產生了一種具有細胞毒性作用的生物被膜，這種生物被膜包含了一種革蘭染色陰性顆粒，其基因序列為16sr RNA。這些顆粒被命名為“納米細菌”。納米細菌是革蘭氏陰性菌，其直徑大約為80～500 nm，約為普通細菌的1%。納米細菌一般呈球狀樣或球桿狀樣，有較厚的細胞壁，無鞭毛和莢膜。因此本課題組推測納米細菌在泌尿系結石的形成過程中可能起到了病因學作用，但是以往研究都只是用腎結石患者尿液或者結石培養出納米細菌或者通過鼠尾靜脈注射納米細菌誘導結石形成，但是納米細菌引起結石具體作用機制仍不清楚且未進行動態觀察研究。近年來眾多學者對Claudin-14的研究為我們研究納米細菌的作用機制提供了新思路。

本實驗結果顯示第4周以后納米細菌組Wistar雄性大鼠腎小管內發現晶體顆粒沉積，而對照組Wistar雄性大鼠未見上述改變；且納米細菌組與對照組比較差異有統計學意義，表明納米細菌確實能夠引起結石的形成。Claudin-14作為緊密連接蛋白家族的一員，嚴格定位于腎臟的髓袢升支粗段(thick ascendinglimb,TAL)[21]，是構成TAL細胞旁途徑的重要組成蛋白，可通過調節細胞旁途徑的緊密連接蛋白-16(Claudin-16)和緊密連接蛋白-19(Claudin-19)構成的雜聚肽陽離子通道滲透率來影響腎小管對鈣的重吸收[22-24]。腎臟對于鈣離子排泄是極為重要的，以此來穩定血鈣水平，Claudin-14作為腎臟排泄鈣離子的重要影響因子，在此過程中扮演極其重要的作用[25]。qRT-PCR和免疫組織化學結果顯示：納米細菌組Claudin-14基因和蛋白從第4周起表達水平增高并且較對照組明顯增多。其升高機制可能是納米細菌激活位于近端腎單位的基底外側的血漿細胞膜上的鈣敏感受體(calcium sensitive receptor，CaSR)，而升高的CaSR可通過調節位于TAL的Claudin-14的表達來增強CaSR-Claudin-14通道的功能，抑制腎小管對鈣離子的重吸收，從而導致高鈣尿，影響結石的形成[6-7]。這表明Claudin-14表達增強可能在納米細菌結石形成中起重要作用。與以往乙二醇建立腎結石模型觀察Claudin-14的表達相比較，本實驗應用納米細菌建立腎結石模型，動態觀察Claudin-14的表達。

綜上所述，Wistar雄性大鼠在注射納米細菌4周后，Claudin-14的表達逐漸增強，可能是納米細菌通過調控Claudin-14的表達，抑制腎小管對鈣離子的重吸收，增加尿鈣，促進結石的形成。但是納米細菌是如何影響Claudin-14的表達，其具體作用機制仍有待進一步深入研究。