IDH-1在膠質瘤中的表達及相關因素分析

王修成 王新軍 曾凡濤

鄭州大學第五附屬醫院神經外科，河南 鄭州 450052

膠質瘤是顱內常見的惡性腫瘤之一，約占顱內惡性腫瘤的81%[1]。根據WHO分級系統，腦膠質瘤分為四級，其中Ⅰ/Ⅱ級為低級別膠質瘤，Ⅲ/Ⅳ為高級別膠質瘤。目前，膠質瘤的治療手段多以手術切除+術后放化療為主，手術切除范圍及放化療程度、是否復發與患者預后相關[2-8]，并且術中皮層電生理檢測及清醒開顱手術等技術已在許多醫院開展[9-11]。替莫唑胺及干擾素等化療藥物的積極應用[12-15]，對膠質瘤的綜合治療已足夠積極，但由于膠質瘤浸潤性生長的生物學特性使其切除干凈難度加大[16]，預后效果并不理想。除少數低級別膠質瘤(如毛細胞星形細胞瘤)可以通過積極手術治療，預后較好以外，大部分膠質瘤患者接受多種治療手段治療后仍復發(膠質母細胞瘤等)，平均生存期只有1 a。據文獻報道，其5 a生存期<9.8%[17-19]。近年來膠質瘤發病率呈上升趨勢，所以對膠質瘤的診治顯得尤為重要。

異檸檬酸脫氫酶(IDH)是三羧酸循環過程中的關鍵酶，其在生物的能量代謝及生物合成/抗氧化等方面具有重要作用，所以其結構及生理活性的改變可直接影響整個三羧酸循環，進而可導致機體的正常代謝改變。目前已知IDH1的基因突變與膠質瘤的發生、發展有一定關系[20-25]，而目前IDH1的表達情況與膠質瘤及相關因素之間的關系研究較少。本文探討膠質瘤中IDH1的表達及其相關因素，為膠質瘤的發生、發展等進一步探索提供依據。

1 資料與方法

1．1一般資料收集鄭州大學第五附屬醫院2015-01—2017-05手術切除經病理確診的92例腦膠質瘤標本，按病理分級分成2組：低級別組(Ⅰ/Ⅱ)60例，高級別組(Ⅲ/Ⅳ)32例，其中星形膠質細胞瘤44例，少突膠質細胞瘤24例，星形-少突膠質細胞瘤12例，膠質母細胞瘤12例；男44例，女48例；年齡1～75歲，平均42.9歲，青少年(7～40歲)30例，中年(41～65歲)52例，老年(>65歲)10例。取同期因顱腦外傷行“開顱減壓術”獲取的正常腦組織20例。

1．2實驗材料兔IDH1多克隆抗體(型號為K003272P)購自北京索萊寶公司，山羊血清封閉液購自北京索萊寶公司，羊抗兔二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶公司，過氧化氫酶阻斷劑購自北京索萊寶公司。

1．3實驗方法手工免疫組化染色檢測IDH1的步驟：常規石蠟包埋組織，切片厚度3 μm，60度烤箱中烤片1 h，常規脫臘、脫水后用pH 6.0檸檬酸鈉120 ℃的條件下進行抗原修復2.5min。室溫條件下3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶10 min，山羊血清封閉恒溫箱內15 min，PBS洗3遍/3 min，加入1抗(1：50)4 ℃冰箱過夜，加入2抗(1：100)37 ℃恒溫箱孵育0.5 h，DAB顯色，并在顯微鏡下觀察顯色程度，待出現淺棕色本底時及時終止，時間為1.5 min。蘇木素復染，清水反藍，依次水化脫臘，中性樹膠封片。取已證實的膠質瘤切片一抗加IgG作為陰性對照，另取已證實的膠質瘤切片一抗加PBS作為空白對照。

IDH1在胞核和胞質均有表達，因此可通過胞核和胞質內棕褐色及棕黃色等判斷陽性細胞，結果按陽性細胞百分比和顯色程度綜合評分。(1)陽性著色細胞數，每張切片觀察5個高倍視野，計數陽性細胞百分比，陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。(2)陽性著色強度：無色為零分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(3)兩者相乘即為陽性等級：0分為陰性(-)，1～4為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1．4統計學處理采用SPSS 17.0進行統計學處理，不同病理級別、性別、年齡中IDH1表達程度比較用χ2檢驗。不同類別膠質瘤及膠質瘤患者有無伴發癲癇中IDH1表達程度比較用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

膠質瘤中IDH1的表達程度與臨床因素之間的關系：膠質瘤中IDH1的表達程度與病理級別(χ2=11.25，P=0.000 8)、年齡(χ2=7.224，P=0.027)及是否伴發癲癇(χ2=4.147，P=0.014 71)具有相關性。與性別(χ2=0.046，P=0.83)及病理分型無相關性(χ2=6.74，P=0.080 66)。見表1、圖1。

3 討論

自從發現膠質瘤與IDH1的關系以來，關于兩者之間的研究越來越多。目前已經證實IDH1的突變在膠質瘤的發生、發展中有重要作用[26-30]。IDH1突變型已可作為膠質瘤常規檢查指標，而對于IDH1在膠質瘤細胞中的表達情況與膠質瘤本身的發生、發展目前研究較少。本研究發現，IDH1的表達程度與膠質瘤的病理分級、是否伴發癲癇及發病年齡具有相關性，進而可為膠質瘤的早期發現、診斷等方面提供一定依據。

本試驗發現，IDH1的表達程度與病理分級具有相關性，可能因膠質瘤的惡性程度較高，細胞分化不完全，增殖活躍，引起IDH1的表達程度增高。對判斷膠質瘤的級別有一定指導意義。在低級別膠質瘤中12例出現高表達，其中一級4例，二級8例。一級患者中3例年齡<10歲，了解其相關病史未見明確誘因，考慮可能存在導致患者在年齡較小出現IDH1的高表達的因素，可能提示患者預后不良，需進一步觀察，也可能由于免疫組化染色技術的誤差導致。高級別膠質瘤中12例中出現低表達，其中3級8例，4級4例，可能在高級別膠質瘤中存在抑制IDH1表達的未知原因，也從一定程度上說明膠質瘤的發生、發展是多因素共同作用導致的結果[31-33]。

表1 膠質瘤中IDH1的表達程度與病理級別、性別、年齡、是否伴發癲癇、病例分型的關系

目前已知癲癇與膠質瘤的級別有相關性。低級別的膠質瘤癲癇發生率較高，常需要積極治療[34-37]。對膠質瘤合并癲癇患者中IDH1的表達程度研究發現兩者之間具有相關性，即合并癲癇患者腦細胞中IDH1的表達程度較未合并癲癇患者低，查閱患者病例資料發現，合并癲癇的多數為低級別膠質瘤，與前面所述符合。可能IDH1的表達與癲癇之間具有潛在的相互作用，可通過觀察膠質瘤中IDH1表達程度的高低預測患者發生癲癇的風險大小，具有一定的指導意義。

不同年齡段之間的IDH1表達程度對比差異有統計學意義，且在青少年和老年中IDH1高表達所占比例高，中年IDH1高表達所占比例較低，回顧病例資料發現，中年患者數量最多，并且低級別患者占多數，導致不同年齡段患者之間IDH1的表達程度出現差異。

膠質瘤作為威脅人類健康的惡性腫瘤之一，發病有上升趨勢，環境惡化及現代人生活、飲食的變化及電離輻射[38-42]可能為膠質瘤發展的部分原因。所以膠質瘤的診斷治療亟待解決，雖然目前已發現IDH1突變、HMGB1、TLR4、ERCC、VEGF、TGF、MicroRNA等因素與膠質瘤的發生發展有一定關系[43-47]，但對于膠質瘤的早期發現診斷仍無特異性標志物。本研究顯示，IDH1的表達程度與病理級別有相關性，可能為膠質瘤的早期診斷提供依據，具有一定的指導意義。后期將致力于研究癌灶和癌旁之間IDH1表達程度是否存在差異，希望為癌癥細胞早期的遷移及轉移的研究有所發現。同時也將探索導致患者在年齡較小出現高表達的原因及導致高級別出現低表達的因素，以及DH1表達與癲癇之間是否存在潛在聯系，為膠質瘤的研究提供一定的思路和方向。

Figure1IDH1immunohistochemicalstaininginnormalbraintissues，epileptogenicfocustissuesandgliomatissues(×400，scale=50μm)A：negativeinnormalbraintissues；B：IDH1stainingingliomawithepilepsytissues(Ⅰ)；C：IDH1stainingingliomawithepilepsytissues(Ⅱ)；D：IDH1stainingingliomawithoutepilepsytissues(Ⅲ)；E：IDH1stainingingliomawithoutepilepsytissue(Ⅳ)