重度阿爾茨海默病血清差異表達(dá)microRNA靶基因功能初步分析☆

羅新妮 寧玉萍 施海珊 侯樂 方子妍

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是進(jìn)展性神經(jīng)退行性癡呆疾病，給社會(huì)和患者家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)[1]。微小 RNA（microRNA,miRNA）是一類長(zhǎng)度為19～23個(gè)核苷酸的高度保守非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，對(duì)神經(jīng)元形成、分化、突觸塑造等過程具有重要調(diào)節(jié)作用。研究miRNA表達(dá)譜變化規(guī)律可了解AD發(fā)病過程[2]。有研究表明差異表達(dá)的miRNAs對(duì)AD患者具有良好的診斷敏感度和特異度[3]，且部分miRNAs在AD患者的血清和腦脊液均與對(duì)照組存在表達(dá)差異[4]。但目前研究鮮有針對(duì)重度AD患者miRNA表達(dá)譜的研究。本研究使用高通量測(cè)序技術(shù)全面分析重度AD的血清miRNA表達(dá)譜特征，挖掘在重度AD患者血清中差異表達(dá)的miRNA，通過gene ontology（GO）功能富集分析和Kyoto encyclopedia of gene and genomes（KEGG）通路富集分析初步探索這些miRNA參與的生物學(xué)功能和通路，為深入探討miRNA與AD發(fā)病機(jī)制的關(guān)聯(lián)及尋找AD生物標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象重度AD組為2016年3月至6月廣州市惠愛醫(yī)院住院AD患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版》（DSM-Ⅳ）癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)，及美國國立神經(jīng)病語言障礙卒中研究所和AD及相關(guān)疾病協(xié)會(huì)（NINCDS-ADRDA）中“很可能的阿爾茨海默病”診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，由2名神經(jīng)內(nèi)科副高或以上職稱醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估和診斷；②簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查表（mini-mental state ex amination,MMSE）評(píng)分低于界值，即文盲≤17分、小學(xué)≤20分、初中及以上≤24分；③蒙特利爾量表 （Montreal cognitive assessment,MoCA）≤26分；④臨床癡呆評(píng)定量表 （clinical dementia rating,CDR）為3分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他腦部器質(zhì)性改變所致癡呆，如腦出血、腦梗死、占位性病變等；②代謝性疾病、物質(zhì)濫用及感染所致癡呆；③混合性癡呆；④患有其他重大軀體疾病或精神障礙。共收集7例重度AD患者。

對(duì)照組為2016年3月至6月在廣州市惠愛醫(yī)院公開招募的無認(rèn)知障礙表現(xiàn)老年人。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥60歲；②無認(rèn)知障礙主訴和癥狀，由2名神經(jīng)內(nèi)科副高或以上職稱醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估；③神經(jīng)系統(tǒng)體查正常；④MMSE評(píng)分高于界值，即文盲＞17分，小學(xué)＞20分，初中及以上＞24分；⑤CDR為0分；⑥無神經(jīng)或精神疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有腦器質(zhì)性病變；②患有其他重大軀體疾病。共收集5名對(duì)照。

本研究經(jīng)過廣州市惠愛醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象或其法定監(jiān)護(hù)人均自愿簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1血清采集和處理 所有被試者于清晨空腹肘靜脈穿刺采血5mL，用EDTA抗凝管收集。樣品在4℃下3000rpm離心15min，聚乙烯管分裝血清，置-80℃凍存待測(cè)，避免反復(fù)凍融。

1.2.2總RNA提取及純度、濃度檢測(cè) Trizol法提取單個(gè)血清樣本的總RNA，采用超微量紫外分光光度計(jì)（Nanodrop2000，美國）和芯片生物分析儀（Agilent2100，美國）測(cè)定RNA的純度和濃度。本研究樣品RNA溶液的OD260/OD280比值均在1.8～2.0，RNA含量在20ng以上，純度和濃度均符合測(cè)序要求。

1.2.3構(gòu)建文庫、測(cè)序和數(shù)據(jù)質(zhì)控分析 RNA溶液經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 （polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）， 將分子量在18～30nt的 RNA分子切膠富集，然后連接3’和5’接頭，對(duì)連接了兩側(cè)接頭的小RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，生成cDNA文庫，并用高通量測(cè)序儀（Illumina HiSeqTM2500，Illumina，美國）進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過去污染、去低質(zhì)量、去接頭的過程獲得干凈tag序列。對(duì)tag序列進(jìn)行長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)，數(shù)量及豐度、基因組比對(duì)等分析；與miRBase數(shù)據(jù)庫比對(duì)鑒定樣品中miRNA，得到miRNA表達(dá)譜（基迪奧生物，廣州）。

1.2.4差異表達(dá)miRNA分析 采用edgeR軟件對(duì)AD和對(duì)照組間miRNA的count值進(jìn)行差異分析，并使用負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)計(jì)算組間比較P值，利用miRNA的表達(dá)量值 （transcripts per million，TPM）進(jìn)行差異倍數(shù)計(jì)算。差異表達(dá)miRNA（differentially expressed miRNA，DEmiRNA）是指在AD和NC兩組的表達(dá)差異倍數(shù) （fold change，F(xiàn)C）絕對(duì)值≥2且P＜0.05的 miRNA[6]。

1.2.5靶基因預(yù)測(cè)、GO及KEGG分析 使用RNAhybrid（v2.1.2）+svm_light （v6.01）、Miranda （v3.3a）及TargetScan（v7.0）3個(gè)軟件對(duì)DEmiRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，以3個(gè)分析結(jié)果的交集作為靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果。對(duì)靶基因進(jìn)行GO功能和KEGG生物通路注釋，統(tǒng)計(jì)靶基因映射到的GO功能和KEGG生物通路的基因數(shù)目，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)計(jì)算P值，找出與整個(gè)基因組背景相比靶基因顯著富集的GO term和 Pathway，以P＜0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，滿足此條件的GO term或Pathway定義為靶基因顯著富集的GO term或Pathway。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。重度AD組和對(duì)照組的年齡、受教育年限、認(rèn)知測(cè)試分值等正態(tài)分布資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，性別比較采用Fisher精確檢驗(yàn)，miRNA在兩組間表達(dá)差異采用負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)與臨床資料7例患者中男2例、女5例，年齡55～92歲，平均（72.2±12.3）歲，病程2～10年，平均（5.86±3.02）年，MMSE 評(píng)分2～14分，平均為（2.7±5.0）分，MoCA 評(píng)分0～5分，平均（0.7±1.9）分。5名對(duì)照中男3名、女2名，年齡62～70歲，平均（65.6±3.6）歲，MMSE 評(píng)分28～30分，平均（28.8±0.8）分，MoCA 評(píng)分26～28分，平均（26.6±1.1）分。兩組性別（P=0.558）、年齡（t=1.140，P=0.281）及受教育年限（t=-1.544，P=0.122）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重度 AD 組 MMSE （t=-11.303，P＜0.001） 和 MoCA（t=-27.091，P＜0.001）評(píng)分低于對(duì)照組。

2.2 miRNA測(cè)序結(jié)果與對(duì)照組相比，重度AD組中共有112個(gè) DEmiRNA（|FC|≥2且P＜0.05），其中上調(diào)57個(gè)，下調(diào)55個(gè)。上調(diào)且測(cè)序reads數(shù)≥10的主要 DEmiRNA 包括 mir-206-y（FC=5.8，P＜0.01）、hsa-miR-199a-3p（FC=4.9，P=0.02）、hsamiR-199b-3p（FC=4.9，P=0.02）、mir-1-y（FC=4.6，P=0.02）、hsa-miR-1307-3p（FC=4.6，P=0.03）、hsa-miR-1-3p（FC=4.4，P=0.03）及 hsa-miR-4446-3p（FC=3.9，P=0.04），下調(diào)且測(cè)序 reads數(shù)≥10的 DEmiRNAs為 hsa-miR-215-5p（FC=-3.4，P＜0.01）。 見表1。

表1 主要DEmiRNA的名稱、序列及表達(dá)差異倍數(shù)

2.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析GO功能富集分析結(jié)果表明DEmiRNA的靶基因參與蛋白結(jié)合、離子結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)金屬結(jié)合等分子功能的調(diào)節(jié)（表2），細(xì)胞內(nèi)器官、細(xì)胞器官、細(xì)胞膜組成器官及細(xì)胞膜等調(diào)節(jié)（表3），以及生物代謝過程和生物調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程（表4）。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示有6.42%的靶基因參與PI3KAkt信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、粘連復(fù)合體等也是DEmiRNA靶基因主要參與的通路（表5）。圖1是靶基因參與PI3K-Akt信號(hào)通路的KEGG通路分析圖，其中紅色方框?yàn)镈EmiRNA的靶基因。

表2 GO富集的分子功能分析

圖1 靶基因參與PI3K-Akt信號(hào)通路的KEGG通路分析圖。原圖來自KEGG數(shù)據(jù)庫（www.genone.jp/kegg/），其中紅色方框?yàn)橹囟華D患者DEmiRNA的靶基因

表3 GO富集的細(xì)胞組成分析

3 討論

表4 GO富集的生物學(xué)過程分析

本研究使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)重度AD患者的血清miRNA進(jìn)行研究，結(jié)果提示重度AD組和對(duì)照組的血清miRNA表達(dá)譜存在部分差異。與AD及輕度認(rèn)知障礙（mild cognitive impairment,MCI）患者血清miRNA的研究結(jié)果一致[3-4,7]。此外，本研究證實(shí)mir-206-y及hsa-miR-215-5p是DEmiRNA，在重度AD患者血清中前者表達(dá)上調(diào)，后者表達(dá)下調(diào)。miR-206-y和hsa-miR-215-5p與AD的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系：在AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，miR-206表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)減少[8]；而miR-215表達(dá)下降能夠重新激活細(xì)胞周期，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，從而引起神經(jīng)退行性改變[9]；且遺忘型MCI患者血清miR-206表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組[7]，可作為預(yù)測(cè)遺忘型MCI患者癡呆轉(zhuǎn)化率的生物標(biāo)志物[10]。本研究進(jìn)一步證實(shí)mir-206-y和hsa-miR-215-5p是AD疾病潛在的生物標(biāo)志物。

表5 靶基因主要富集的10個(gè)KEGG通路

本研究中GO功能富集分析顯示DEmiRNA的靶基因參與蛋白結(jié)合、離子結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)金屬結(jié)合、細(xì)胞器與細(xì)胞膜等生物代謝和調(diào)節(jié)過程。以上生物代謝和調(diào)節(jié)過程被證實(shí)與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)：研究顯示AD患者大腦的老年斑中富含金屬離子[11]；AD患者腦內(nèi)葡萄糖代謝降低遠(yuǎn)早于β淀粉樣蛋白沉淀發(fā)生，而酮體是腦內(nèi)替代葡萄糖的主要能量來源，腦中能量代謝底物轉(zhuǎn)換為酮體是AD早期代謝特征[12]。本研究提示血清DEmiRNA與AD的病理變化存在一致性，但其關(guān)聯(lián)性仍需進(jìn)一步探索。

在KEGG通路分析中，本研究發(fā)現(xiàn)DEmiRNA的靶基因主要參與PI3K-Akt信號(hào)通路調(diào)控。既往研究顯示，PI3K-Akt信號(hào)通路與AD患者海馬神經(jīng)元的生存、凋亡和細(xì)胞代謝密切相關(guān)[13-14]。β淀粉樣（Aβ）蛋白低聚體阻斷PI3K-Akt信號(hào)通路時(shí)可導(dǎo)致大腦神經(jīng)元易損傷性增加[15]，提示PI3K/Akt信號(hào)通路參與AD的病理改變過程。本研究提示重度AD患者血清DEmiRNA或可反映AD患者大腦PI3K-Akt信號(hào)通路調(diào)控的異常情況。

綜上所述，本研究表明重度AD患者血清存在顯著的miRNA表達(dá)差異，其中mir-206-y和hsa-miR-215-5p是AD疾病潛在的生物標(biāo)志物。且GO功能和KEGG通路富集分析提示血清DEmiRNA作用的靶基因與AD病理改變密切相關(guān)。考慮到重度AD患者的特征性病理變化更明顯，血清microRNA譜系的改變可能較輕中度AD更為典型，本研究?jī)H納入重度AD患者，而未納入不同病程階段的認(rèn)知功能障礙患者，并且本研究樣本量較小，僅初步探索miRNA差異表達(dá)，靶基因分析亦有待深入，這些不足需在未來研究中加以改進(jìn)。