精神分裂癥發(fā)作期與緩解期腸道菌群高通量測序分析☆

張言武 白麗君 程強 張許來 高嬌嬌 段俊 徐紫菡 易偉卓 潘如兵魏倩楠 蘇虹

精神分裂癥發(fā)作是遺傳、環(huán)境、社會心理等因素共同作用的結(jié)果，但其確切病因尚不明確[1]。近年來腸—腦軸的提出為精神分裂癥機制研究提供了新思路，最近研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者腸道菌群與健康人群相比存在差異，腸道菌群失衡可能是精神分裂癥發(fā)病的危險因素[2-6]。但現(xiàn)有研究無法明確精神分裂癥患者的腸道菌群失衡是癥狀標志還是疾病特征性標志，即腸道菌群失衡是否在精神分裂癥的發(fā)作中發(fā)揮作用。為了探索腸道菌群在精神分裂癥發(fā)作中的作用，本研究采用16S rRNA基因高通量測序技術(shù)，分析精神分裂癥發(fā)作期和緩解期患者腸道菌群的差異，為精神分裂癥發(fā)作的臨床干預提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2018年4月至2018年8月安徽省精神衛(wèi)生中心住院的精神分裂癥發(fā)作期患者為發(fā)作組，精神分裂癥緩解期患者作為對照組。納入標準：①年齡18～60歲，漢族，合肥本地居民；②符合 《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition,DSM-Ⅳ）精神分裂癥的診斷標準；③發(fā)作組陽性與陰性癥狀量表（positive and negative syndrome scale,PANSS）評分≥60，對照組PANSS評分＜60；④對照組年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（body mass index,BMI）與發(fā)作組相匹配；⑤抗精神病藥物治療＞6個月且用藥方案近期無變化。排除標準[3]：①合并其他精神疾病；②有宗教信仰；③有吸煙史或飲酒史；④過去6個月內(nèi)飲食習慣有明顯變化；⑤過去6個月內(nèi)使用過抗生素、皮質(zhì)類固醇激素、細胞因子、益生菌或益生元等；⑥合并慢性軀體疾病，如癌癥、高血壓、糖尿病、自身免疫性疾病、炎癥性腸病等；⑦近3個月有腹瀉；⑧近5年行胃腸外科手術(shù)、胃鏡檢查、結(jié)腸鏡檢查或胃腸鋇餐等。共納入25例患者，其中發(fā)作組12例，對照組13例。所有患者均簽署知情同意書。本次研究經(jīng)過安徽醫(yī)科大學倫理委員會審批。

1.2 研究方法

1.2.1人口學與臨床資料收集 精神分裂癥患者人口學資料和臨床特征來自醫(yī)院病案系統(tǒng)，包括年齡、性別、身高、體重、病程和發(fā)病年齡等。

1.2.2糞便標本采集與處理 用無菌采集器采集研究對象的新鮮糞便樣本0.5g左右，-80℃保存。糞便腸道菌群 DNA提取采用 QIAamp（Qiagen，德國）糞便DNA提取試劑盒，嚴格按照說明書操作。提取后的DNA用紫外分光光度計檢測。通過PCR反應擴增16S rRNA基因V4區(qū)，引物為515F（5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′） 和806R （5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′）。反應條件：95℃預變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25個循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物純化后送廣州華銀醫(yī)學檢驗中心Illumina Miseq平臺進行測序。

1.2.3高通量測序數(shù)據(jù)處理 糞便DNA測序數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾，濾除低質(zhì)量的reads，通過reads之間的Overlap關(guān)系將reads拼接成Tags；在97%相似度下將Tags聚成操作分類單元 （operational taxonomic units，OTU），然后通過OTU與Silva數(shù)據(jù)庫比對，對OTU進行物種注釋，基于OTU和物種注釋結(jié)果進行α多樣性分析和屬水平上菌群構(gòu)成分析。α多樣性分析采用chao指數(shù)、ace指數(shù)、shannon指數(shù)及simpson指數(shù)，chao和ace指數(shù)越大反映樣品中物種豐富度越高，shannon指數(shù)越大、simpson指數(shù)越小，反映群落的多樣性越高。屬水平上菌群構(gòu)成分析采用菌群相對豐度。

1.3 統(tǒng)計學方法采用Excel錄入和整理數(shù)據(jù)，SPSS23.0進行統(tǒng)計分析。患者年齡、BMI、病程和發(fā)病年齡等組間比較采用獨立樣本t檢驗，性別等分類資料比較采用Fisher's確切概率法。兩組間腸道菌群α多樣性各指數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，屬水平上菌群相對豐度呈偏態(tài)分布，用中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）[M（QL，QU）]描述，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。菌群相對豐度與PANSS評分、病程、發(fā)病年齡相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。檢驗水準α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 人口學資料和臨床特征發(fā)作組患者的年齡（t=-0.079，P=0.938）、 性別 （P=1.000）、BMI （t=0.405，P=0.689）、病程（t=0.491，P=0.628）和發(fā)病年齡（t=-0.506，P=0.617）與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義。發(fā)作組的PANSS評分高于對照組（t=-6.393，P＜0.001）。 見表1。

2.2 測序結(jié)果和α多樣性分析25個樣本測序得到高質(zhì)量序列1267787條，平均長度（252±1）bp，樣品文庫覆蓋率均超過98%。通過序列聚類，共獲得OUT1400個，其中發(fā)作組1135個OTU，對照組1221個OUT，956個OUT為兩組共有。α多樣性結(jié)果顯示，發(fā)作組 chao指數(shù) （t=2.385，P=0.026）、ace 指數(shù)（t=3.068，P=0.005）低于對照組，而 shannon 指數(shù)（t=0.756，P=0.457）和 simpson 指數(shù)（t=-0.093，P=0.927）在兩組間無統(tǒng)計學差異。見表2。

表1 發(fā)作組與對照組患者人口學資料和臨床特征

表2 發(fā)作組與對照組間腸道菌群α多樣性

2.3 屬水平上腸道菌群構(gòu)成分析在屬的水平上，兩組共檢測到52個菌屬，見圖1。其中發(fā)作組相對豐度較高的菌屬有擬桿菌屬（Bacteroides）36.25%、糞桿菌屬（Faecalibacterium）4.19%、另枝菌屬 （Alistipes）2.60%、 薩特氏菌屬（Sutterella）1.52%、梭桿菌屬（Fusobacterium）0.44%、巨單胞菌屬 （Megamonas）0.42% 和 普 氏 菌 屬 （Prevotella）0.15%；對照組有普氏菌屬14.94%、擬桿菌屬11.13%、糞桿菌屬3.54%、薩特氏菌屬2.57%、另枝菌屬1.96%、巨單胞菌屬0.07%和梭桿菌屬0.07%。發(fā)作組擬桿菌屬相對豐度高于對照組（Z=-2.013，P=0.044）， 而普氏菌屬低于對照組（Z=-3.427，P=0.001），差異有統(tǒng)計學意義。 見表3。

圖1 屬水平上物種注釋柱狀圖

表3 兩組間屬水平上菌群相對豐度[M（QL,QU）]

2.4 擬桿菌屬、普氏菌屬與臨床特征的相關(guān)性分析 擬桿菌屬相對豐度與病程 （r=-0.112，P=0.594）、發(fā)病年齡（r=0.292，P=0.156）、PANSS 評分（r=0.288，P=0.163）相關(guān)性無統(tǒng)計學意義。普氏菌屬相對豐度與PANSS評分呈負相關(guān)，關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計學意義（r=-0.578，P=0.003），與病程（r=-0.118，P=0.575）和發(fā)病年齡（r=-0.105，P=0.618）相關(guān)性無統(tǒng)計學意義。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥發(fā)作期患者腸道菌群豐富度低于緩解期患者，擬桿菌屬相對豐度高于緩解期患者，而普氏菌屬相對豐度低于緩解期患者。腸道菌群豐富度降低提示腸道微生態(tài)發(fā)生紊亂。腸道微生態(tài)能夠通過菌群—腸—腦軸影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)[7]，進而可能對精神分裂癥發(fā)作產(chǎn)生影響。擬桿菌屬在精神分裂癥發(fā)作期患者中相對豐度升高，其作用機制可能與炎癥因子有關(guān)。2018年GAO等[8]的實驗研究就提示擬桿菌屬與大腦皮質(zhì)中白介素 （interleukin,IL）-6水平呈正相關(guān)，與認知能力呈負相關(guān)。而IL-6可以激活腦犬尿氨酸（kynurenine,KYN）途徑，導致 N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑犬尿喹啉酸（kynurenic acid,KYNA）的合成增加，進而影響腦內(nèi)谷氨酸能/多巴胺能神經(jīng)傳遞[9]。另一方面，普氏菌屬能夠維持人體腸道微生物組的正常群落結(jié)構(gòu)[10]，利用碳水化合物產(chǎn)生短鏈脂肪酸 （short-chain fatty acids，SCFAs），SCFAs可改善腸屏障功能[11]，當SCFAs減少時，腸屏障功能減弱，可能引發(fā)細菌移位和炎癥反應。本研究結(jié)果提示擬桿菌屬和普氏菌屬可能在精神分裂癥發(fā)作中發(fā)揮重要作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)普氏菌屬相對豐度與PANSS評分呈負相關(guān)，提示菌群可能影響精神分裂癥患者的癥狀，通過調(diào)節(jié)普氏菌屬的相對豐度可能使患者癥狀改善。但本研究表明擬桿菌屬相對豐度與PANSS評分無統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)，這與以往研究結(jié)果存在差異[5,12]。SCHWARZ等[12]研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬與首發(fā)精神病患者簡明精神量表得分呈正相關(guān)，NGUYEN等[5]發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬與精神分裂癥患者的抑郁癥狀存在正相關(guān)。研究結(jié)果不一致可能與研究人群和地區(qū)不同有關(guān)，提示腸道菌群與精神分裂癥癥狀的關(guān)聯(lián)仍需進一步探索。

精神分裂癥腸道菌群相關(guān)研究較少，既往研究多分析精神分裂癥患者或超高危人群與健康對照腸道菌群的差異[2-6]。而本研究分析精神分裂癥發(fā)作期與緩解期患者腸道菌群的差異，探討腸道菌群在精神分裂癥發(fā)作中的作用，為精神分裂癥發(fā)作的臨床干預提供了新思路。但本研究存在以下局限性：首先樣本量偏少，影響結(jié)果的穩(wěn)定性，且可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，如擬桿菌屬相對豐度與精神癥狀未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)；其次發(fā)作組與對照組不是同一研究對象，個體差異可能干擾結(jié)果，而通過匹配可在一定程度上減小個體差異的影響；最后本研究未控制飲食和運動等因素，盡管研究對象均來自醫(yī)院，短期院內(nèi)飲食相似，但仍需考慮個人飲食習慣的差異。這提示在未來的研究中宜采用縱向隊列，同時擴大樣本量，控制飲食等因素對腸道菌群的影響。