內蒙古奶豆腐中優良乳酸菌的篩選及發酵性能研究

林麗清，汪欣，夏九學，姜甜，方曙光

（江蘇微康生物科技有限公司，蘇州 215000）

0 引 言

隨著生活水平的提高，人們對酸奶的認知也越來越多，需求量也在日益增加，自然對酸乳的風味也有較高的要求，而酸奶發酵劑作為酸奶制作過程中主要的微生物培養材料，在乳制品發酵過程中有著至關重要的作用，對發酵乳制品風味和質地的形成以及品質具有重要的影響[1]。酸乳發酵主要是乳酸菌主導的過程，傳統發酵乳制品較好的保留了乳酸菌的發酵特性與風味，使發酵酸乳的香氣與風味更為突出[2]，其中乳酸菌的產酸性能、持水性和蛋白水解能力對酸乳的狀態和風味有很大的影響[3-4]。市售乳酸菌常被作為發酵劑用于食品工業中提升酸奶等發酵食品的質地、風味和營養價值[5]。因此，對乳酸菌發酵劑發酵性能的篩選方法和發酵條件的研究成為很多學者的研究熱點。

我國是最早利用乳酸菌發酵食品的國家之一，有著豐富的傳統發酵食品資源，遼闊地域上各民族都有獨特的民族特色傳統發酵乳制品，在新疆、內蒙、甘肅等地，長期的游牧生活孕育了很多優質的益生菌[6-7]。如酸馬奶、奶豆腐、奶酪、稀奶油、奶疙瘩等，這些乳制品中含有豐富的乳酸菌，自然選擇的結果是這些乳酸菌很好地保存了其生物學特性，同時制作方法有著明顯的地域性以及戶籍性，從而賦予了乳制品濃厚的地域特色和風味，保存了其中有益微生物，尤其是傳接了賦予乳制品獨特風味的乳酸菌的自然特性。奶豆腐,作為內蒙古傳統發酵乳制品之一,具有幾千年的食用歷史，本文以內蒙古傳統乳制品奶豆腐為原料，通過分離、純化篩選出產酸、產香和產粘性能好的乳酸菌發酵菌種，同時從基因分子水平對菌株進行鑒定，為開發具有自主知識產權和性能優越的直投式酸奶發酵劑提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料儀器

1.1.1 材料

內蒙古錫林格勒盟正藍旗不同牧民家庭自制發酵奶豆腐樣品。

1.1.2 培養基

基礎培養基（MRS）：葡萄糖 20.0 g，蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，檸檬酸氫二銨 2.0 g，吐溫-80 1.0 mL，乙酸鈉 5.0 g，磷酸氫二鉀 2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL。

分離培養基：MRS基礎培養基加上2%質量濃度的碳酸鈣，碳酸鈣用牛皮紙包裹，單獨滅菌，臨用時加入。

種子培養基：基礎培養基不加瓊脂。

1.1.3 試劑與儀器

市售純牛奶、白砂糖、三氯乙酸、OPA試劑、甲醇、硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇、亮氨酸、WFZ UV-2000紫外-可見分光光度計、DHG-9053A型電熱鼓風干燥箱、SJH-4S型數控精密恒溫水浴鍋、DG250型厭氧培養箱、CT 14RD型臺式高速冷凍離心機、TA-XT2i型質構儀、三氯乙酸、OPA試劑、甲醇、硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇、亮氨酸、分析天平等。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離

將奶豆腐樣品搗碎后稀釋，選取10-2～10-54個稀釋梯度，吸取1 mL稀釋液，加入到滅菌的平板中，傾入20 mL冷卻到55℃左右的含2%碳酸鈣的MRS培養基，放入厭氧培養箱中，37℃培養72 h[6]。挑選溶鈣圈較大的菌落進行連續劃線至得到純化的單菌落，經革蘭氏染色鏡檢，將典型的鏈球狀菌株保藏。

1.2.2 乳酸菌的鑒定

對純化的菌落提取總DNA，以1492r、27F為引物擴增16SrDNA，將PCR產物純化后送上海生工生物工程有限公司測序。將測定的16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank中已知的16SrDNA序列同源性進行比較，選取屬內同源性較高的模式細菌的16 SrDNA序列進行遺傳距離計算，并根據遺傳距離計算結果用NJ法繪制系統發育樹[7]。

1.2.3 酸奶發酵測試

市售純牛奶中，按比例加入6%的白砂糖，95℃殺菌5 min，冷卻到43℃待用。將活化后的菌株按體積分數1%的比例接種于殺菌處理的純牛奶中，43℃發酵，跟蹤酸度變化，當酸度達到70°T，終止發酵，置于4℃冰箱中冷卻后熟。酸奶冷藏過夜后取出，待酸奶溫度恢復到10～15℃時，選取10名食品專業人員從色澤、滋氣味和組織狀態等方面進行感官評價[7]。

1.2.4 菌種后酸化能力測定

將發酵至70°T的酸奶分裝置于6℃冰箱冷藏，測定第1、5、10、15、20、25 d的酸度,每次實驗重復3次，實驗結果取平均值。

1.2.5 菌種持水力測定

取10 mL酸奶放入離心管中。離心管質量記為w1，加入酸奶后的質量記為w2，離心速度為6 000 r/min，離心10 min，靜置10 min，吸去上清液，此時質量記為w3。持水性計算公式：M=(w3-w1)/(w2-w1)×100%。

1.2.6 蛋白水解能力的測定

通過文獻提供的OPA法測定菌種的蛋白水解能力。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌的分離鑒定

將得到的16 SrDNA測序結果提交到NCBI上進行序列比對，選取相似度較高的模式菌株作為對比，用MEGA5.0軟件構建系統發育樹，進行聚類性分析，得到的系統發育樹如下圖1所示。由系統發育樹可知，所選擇的16株鏈球菌已報道的模式菌Streptococcus thermophilusATCC19258親緣關系最為接近，在NCBI上比對其相似度均在98%以上，因此可以將篩選的16株菌確定為嗜熱鏈球菌，并依次命名為T1-T16。嗜熱鏈球菌是國家規定的可用于食品的菌種之一，酸奶發酵的主要作用菌，對酸奶發酵周期、酸奶質構和風味起著決定性的作用，篩選優良的嗜熱鏈球菌資源對于開發直投式酸奶發酵劑具有十分重要的意義。

圖1 分離得到的細菌的16SrDNA序列的系統發育樹

2.2 分離菌發酵性能研究

2.2.1 酸奶發酵測試

較快的產酸速度一般有利于工業化生產，例如，可以縮短生產周期，增加產能，但過快的發酵速度可能會帶來乳清析出的不良影響。實驗評估了16株篩選的嗜熱鏈球菌發酵酸奶至70°T所需要的時間，同時評價了冷藏后熟后酸奶的口感和風味。如圖2所示，不同菌株產酸速度差異明顯，發酵速度最快的是T 13，270 min即到達發酵終點，其次是T 5，T6，T9，T 16。但T 13感官評分不高，主要體現在風味欠缺，如表1所示，可能跟黏度有關系，一般來說黏度較高的菌，風味相對較弱，但高黏度的菌種可以減少攪拌型酸奶增稠劑的使用，較好的保留酸奶質構，在實際生產中可以跟產香較好的菌種搭配使用。綜合評價T4，T 6，T 8，T 9，T 12，T14，T 16感官評分較高。

圖2 不同菌株發酵過程中酸奶酸度變化

表1 乳酸菌的篩選結果

2.2.2 單菌后酸能力分析

由圖3可知，隨著冷藏時間的延長，這16株菌發酵的酸奶的酸度均呈現出上升趨勢，不同菌株的后酸化能力差異也比較明顯，其中菌株T13的后酸化最明顯，酸度增加了21°T，說明其后酸化能力最強，菌株T 9和T 16冷藏期間酸度變化最小，4℃冷藏20 d后酸度僅增加了9°T，說明后酸化能力弱，符合優良乳酸菌發酵劑具有的特點，其余菌株后酸化能力差異不明顯，儲藏20天后，酸度一般增加11～15°T。

圖3 冷藏過程中酸度變化

2.2.3 單菌株持水性測定

菌株的持水性與發酵乳的品質密切相關，研究表明單菌株的持水性越高，酸乳對水的保持性越高，從而乳清的析出也會大大降低，有利于提高酸乳的品質。由表2可知，菌株T9和T16的持水性較高，這兩株菌發酵酸奶后乳清析出極少，T1次之，T8持水性最低，有少量的乳清析出現象，與前面感官評價結果一致，實驗表明，其持水性較高，發酵酸奶的的品質也較為稠厚，黏度較高，乳清析出較少，適用于制作高黏稠厚質感的酸乳。

表2 單菌株的持水性

2.2.5 單菌株的蛋白水解能力

蛋白質的水解是產生各種風味物質的主要途徑，發酵乳制品蛋白的水解可以增加酸奶的風味和營養價值，但過度的水解也會影響酸奶的質地，因此適度的蛋白水解對改善酸奶風味和質地以及生成活性肽具有重要作用。因此本實驗采用OPA法測定菌株的水解蛋白能力，以便進一步篩選出優良的發酵乳菌株。

由表4可以看出，不同的菌株蛋白水解能力差異很大，這可能與菌株本身的酶系有關，其中菌株T13蛋白水解能力最強，發酵結束后亮氨酸含量為559.52 mg/mL，但感官評分不高，可能與蛋白水解過度有關，菌株T 9具有良好的蛋白水解能力，發酵6 h后，亮氨酸含量達到451.59 mg/mL，然后依次是T 16和T7，而T1和T12的蛋白水解能力保持在相對較低的水平，可能與乳酸菌自身代謝有關，利用了部分氨基酸，具體機理還有待探究。

表3 菌株的蛋白水解能力

3 結論

本實驗利用內蒙古傳統發酵乳制品奶豆腐，通過初篩和復篩，挑選出16株發酵性能良好的嗜熱鏈球菌(T1～T16)，并結合鏡檢觀察、生化試驗以及16SrDNA基因序列分析對菌株進行鑒定。結果顯示這16株菌發酵酸乳至70°T所需時間為4-8 h，各菌株在產酸、持水性以及蛋白水解能力存在差異。菌株T 9和T16各方面的性能均比較好，具有良好的產酸能力，后酸能力弱，并且持水性和蛋白水解能力均比較好，制備的發酵乳酸奶風味濃郁，口感優越，質地良好，可用于開發具有良好發酵特性的直投式酸奶發酵劑。