動物源性食品中氯霉素殘留的快速篩查方法

陳軍

(蘇州出入境檢驗檢疫局，江蘇 蘇州 215021）

0 引 言

氯霉素作為一種殺滅或抑制細菌生長的藥物，曾在一段時間內作為飼料添加劑和獸醫臨床常用藥品，因其通過水產品、肉制品、奶、蛋等對人體產生嚴重的毒副作用[1]，因而美國和歐共體已禁止在動物飼料中使用氯霉素，并規定在動物源食品中不得檢出[2]。有關氯霉素在水產品、畜產品中殘留的檢測方法，國內外報道很多，包括微生物法[3-5]、色譜法[6-8]、免疫測定法[9-10]等，新型生物學檢測技術的發展催生了生物膜干涉技術[11-15]。本文提出一種針對動物源性食品中氯霉素殘留檢測的免疫分析方法，以氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS)為母體直接偶聯物固著在光纖探頭表面，再由光纖光譜分析裝置檢測和識別待測樣品中是否存在目標物以及濃度信息，實現樣品中氯霉素的定量檢測。

1 實驗

1.1 儀器

Octet?RED 96 System生物分子相互作用儀，紫外可見分光光度儀，旋轉蒸發儀，冷凍離心機，臺式冷凍離心機，臺式真空泵，磁力攪拌器。

1.2 試劑

牛血清白蛋白(BSA)，電泳純（進口分裝）；人血清白蛋白(HSA)，電泳純（進口分裝）；氯霉素(CAP)，琥珀酸酐(HS，化學純），三正丁胺（化學純），氯甲酸乙酯（化學純），其他試劑均為AR級。

1.3 方法

1.3.1 免疫原和包被原的制備

（1）氯霉素半琥珀酸酯制備。將CAP、HS、丙酮、吡啶按適當比例混合、攪拌溶解，58～60℃回流2 h，濃縮、蒸去丙酮，加乙酸乙酯和稀鹽酸振蕩去酸層，用10%NaHCO3轉溶，加濃鹽酸調pH值到3，析出糖漿狀物，再用酸乙酯萃取，取有機相旋轉蒸發器濃縮，得氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS)，備用。

（2）氯霉素包被原制備。稱取CAP-HS 21.7 mg溶于3 mL DMF中，4℃預冷10 min，依次加入三丁胺、氯甲酸異丁酯，4℃攪拌20 min；按50∶1的摩爾比(CAP/BSA)稱取BSA，溶于50%的DMF 10 mL中，4℃預冷，用1 mol/L的NaOH調BSA至p H值為8；將前述CAP-HS液迅速加入BSA中，4℃攪拌反應4 h。所得產物以0.05 mol/L pH7.4的PBS透析3 d，得氯霉素包被原Hap-BSA。

（3）氯霉素免疫原制備。稱取48 mg OVA和10 mg氯霉素溶在5 mL冰冷的0.05 mol硼砂緩沖液(pH 8.5，含0.15 mol NaCl)中，4℃攪拌，將所得1.5 mL溶液逐滴加入到該溶液中，避光反應1 h，得氯霉素包被抗原Hap-OVA。

（4）金標氯霉素包被原制備。向1 mL膠體金中加入1μL質量濃度為0.5 g/L的氯霉素抗體，渦旋混勻，室溫靜置15 min，加入100μL質量分數為10%的BSA濃液，室溫封閉顆粒15 min，在轉速為10 000 r/min下離心10 min，棄掉上層清液，加入90μL PB(pH=7.4)，重懸顆粒，備用。

1.3.2 光纖生物傳感器的制備

將APS光纖傳感器末端置于不同濃度的氯霉素-BSA偶聯物溶液中，室溫靜置5 min后再將光纖生物傳感器沒入質量分數為15%蔗糖中，室溫靜置1 min。室溫晾干，置于2～8℃下干燥保存。

1.3.3 牛乳中氯霉素殘留檢測

采用無標記檢測和膠體金標記檢測2種方式對牛乳中氯霉素殘留進行檢測。

(1)無標記BLI檢測。將光纖傳感器末端沒入空白奶液中(200μL牛乳+50μL緩沖液)中120 s進行平衡，再將光纖傳感器末端沒入末端置于待測奶液(200 μL待測牛乳+50μL緩沖液+2μg氯霉素單克隆抗體)中300 s檢測牛乳中氯霉素殘留量。

(2)金標記BLI檢測。將光纖傳感器末端置于奶液中(200μL牛乳+50μL緩沖液+5μL金標BSA)中平衡120 s;然后，將光纖傳感器末端沒入待測奶液(200μL待測牛乳+50μL緩沖液+5μL金標氯霉素素單克隆抗體)中700 s。檢測牛乳中氯霉素殘留量。

1.3.4 膠體金免疫層析檢測

使用膠體金試紙條檢測梯度稀釋的添加氯霉素的牛乳樣品，每個濃度重復3次，具體操作參照牛乳中氯霉素快速檢測試紙條說明書進行。

2 結果與分析

2.1 靈敏度實驗

(1)無標記BLI檢測。用巴氏殺菌奶將該抗體稀釋成質量濃度為0.1 ng/mL的牛奶樣本檢測結果，然后用該液體將氯霉素標準品質量濃度稀釋到100，50，25，12.5，6.25，3.12 ng/mL和 0 ng/mL，進行無標記BLI檢測上機檢測，結果表明靈敏度為2.0 ng/mL(圖1)。

圖1 無標記BLI檢測牛奶中氯霉素殘留實驗結果

(2)金標記BLI檢測。用氯霉素陰性巴氏殺菌奶將氯霉素標準品稀釋至100，50，25，12.5，6.25，3.12 ng/mL和0 ng/mL。采用金標記BLI檢測，檢測靈敏度為0.0125 ng/mL(見圖2)，圖3為重復檢測6次氯霉素質量濃度為0.1ng/mL的牛奶樣本檢測結果。

圖2 金標記BLI檢測牛乳中氯霉素殘留實驗結果

圖3 金標記BLI重復檢測氯霉素加標樣品

由圖3可以看出，采用金標記信號放大技術建立了檢測樣品中四環素類抗生素殘留的方法，說明方法具有良好的靈敏性，可適用于四環素類抗生素殘留的快速定量檢測。

2.2 氯霉素特異性試驗

用建立的金標記BLI方法檢測加標質量濃度為1 000 ng/mL的三聚氰胺、頭孢哌酮、恩諾沙星、青霉素G、安芐青霉素、頭孢哌酮、氟苯尼考和甲砜霉素，檢測結果均為陰性。說明所制備的單抗對氯霉素具有一定的特異性。

2.3 基質對靈敏度的影響

分別用6份原奶、7份來自不同批次的巴氏殺菌奶倍比稀釋氯霉素標準品，分別采用金標記BLI檢測方式進行檢測，靈敏性穩定達到0.0125 ng/mL。

2.4 實際樣品中氯霉素殘留檢測結果

使用氯霉素快速檢測試紙條及LC-MS/MS評價金標記BLI方法的可靠性，檢測20份兩個加標水平的牛乳樣品中氯霉素殘留，金標記BLI與所采用的對照方法的結果見表1，其靈敏度優于膠體免疫層析試紙條，檢測結果與LC-MS/MS一致。

表1 金標記BLI、膠體金免疫層析試紙條及LC-MS/MS檢測牛乳加標氯霉素殘留 ng/mL

3 討 論

利用生物膜干涉技術建立快速檢測動物源性食物樣品中氯霉素殘留的快速篩查方法。本實驗采用膠體金信號放大檢測牛奶中的氯霉素，建立了一種快速檢測動物源性食品中氯霉素殘留的方法，其檢測靈敏性在0.0125 ng/mL以下，與恩諾沙星、三聚氰胺、青霉素G、安芐青霉素、頭孢哌酮、氟苯尼考和甲砜霉素等無交叉反應。該試驗結果表明采用相同的抗原、抗體、納米金、緩沖液及納米金標記抗體工藝，金標記生物膜干涉技術檢測氯霉素殘留的靈敏性要明顯高于免疫層析試紙條的靈敏性，其檢測結果與經典儀器分析一致。

該試驗表明采用金標記BLI技術檢測牛乳中抗生素殘留競爭結合反應需要90 min以上的時間方能達到平臺期，在90 min以內雖然檢測信號一直在提高，但在反應初期即可對陰陽性結果進行判定。另外，該研究中金標記BLI檢測喹諾酮類抗生素的定量范圍較小，并不適用于實際生產中的定量檢測，是一種較好的定性檢測方法。筆者建立的方法雖然檢測周期略長于免疫層析試紙條方法(6 min)，但仍是一種簡便、快捷的檢測方法，可以用于牛乳中喹諾酮類抗生素殘留的快速檢測。

該方法還具有良好的特異性，與牛乳中常見的其他小分子物質無交叉反應。不同人員采用筆者所建立的方法檢測氟甲喹加標牛乳樣品，靈敏度無顯著差異，說明該方法具有良好的穩定性。金標記生物膜干涉檢測技術具有良好的抗干擾能力，不同的樣品基質對于檢測的靈敏性的干擾并不明顯，檢測不同牛乳中氯霉素的靈敏性均達到2.0 ng/mL。

4 結 論

采用金標記信號放大技術建立了檢測牛奶中氯霉素類抗生素殘留的方法，該方法具有良好的特異性及靈敏性，適用于牛奶中氯霉素殘留的快速定量檢測，檢測靈敏性在0.0125 ng/mL以下，與恩諾沙星、三聚氰胺、青霉素G、安芐青霉素、頭孢哌酮、氟苯尼考和甲砜霉素等無交叉反應。