siRNA介導COX-2基因沉默對大腸癌LoVo細胞侵襲及上皮間質轉化的影響

李 明， 譚詩云

武漢大學人民醫院消化內科 消化系疾病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060

大腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，其死亡率高居腫瘤相關死亡的第2位[1-2]。腫瘤發生侵襲、轉移是導致大腸癌患者臨床治療失敗和死亡的主因，因此，探討大腸癌侵襲、轉移的相關機制具有重要意義。上皮細胞間葉樣表型轉化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)是腫瘤原發性浸潤和繼發性轉移的重要機制[3-4]。在包括大腸癌在內的多種腫瘤細胞中均過表達的環氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)與腫瘤侵襲、轉移密切相關，但COX-2表達對大腸癌細胞EMT的影響及其相關機制尚不十分明確，因此，本研究擬通過轉染沉默COX-2小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)片段，觀察下調COX-2表達后對大腸癌細胞侵襲能力、EMT的影響并探討可能的機制，為大腸癌侵襲、轉移及臨床治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料大腸癌細胞系LoVo細胞(中科院上海細胞庫)；胎牛血清(GBICO)；DMEM/F-12培養基(美國Invitrogen公司)；轉染試劑Lipofectamine 2000(Sigma公司)；Transwell小室、細胞培養瓶、細胞培養皿及6孔培養板(Corning公司)；Trizol、Matrigel膠、RT試劑盒(BD公司)；COX-2 siRNA(上海吉瑪公司)(COX-2 siRNA正義鏈5′-GTATGACAACAGCCTCAAGT-3′，反義鏈5′-ACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3′；COX-2陰性對照siRNA序列正義鏈5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTT-3′，反義鏈5′-AACGTGACACGTTCGGAGAA-3′)；COX-2引物(南京金瑞斯生物科技有限公司)；逆轉錄試劑盒(Fermentas公司)；EMT標志物抗體(E-cadherin、Vimentin、Fibronectin)、ERK/MAPK和PI3K/Akt通路相關Akt、p-Akt、p-GSK-3β、ERK和p-ERK抗體、COX-2、MMP-9及內參β-actin抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；蛋白濃度測定試劑盒、HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠(杭州碧云天生物技術研究所)。

1.2方法

1.2.1 細胞培養：大腸癌LoVo細胞在37℃、體積分數為5%的CO2飽和濕度條件的恒溫箱中，用質量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM/F12培養液培養。實驗均選用處于對數生長期的細胞進行。

1.2.2 COX-2 siRNA轉染：取對數生長期的細胞，接種于6孔培養板內，倒置顯微鏡下觀察，當細胞融合度為50%左右時轉染。……