一測多評法測定白芍中的五種成分含量

周光姣，白 華，權春梅，汪盈盈,黃 翔

(1.安徽中醫藥科學院 亳州中醫藥研究所，安徽 亳州 230031；2.亳州職業技術學院，安徽 亳州 236800)

中藥化學成分眾多、復雜，且中醫藥理論強調成分的整體協同作用，故對藥材及其制劑的質量評價慢慢由單一成分評價轉向多指標、整體性評價。一測多評法(QAMS)是利用樣品中物質含量與檢測信號響應值的比例關系，選擇并測定一個成分，以該成分作為內參物，通過方法學考察，建立內參物與其他物質間的檢測響應值比例關系即相對校正因子，利用相對校正因子換算其他物質的含量，實現對其中多個成分含量的測定[1-3]。一測多評法可以實現多種成分的同步測定，提高工作效率，還可以解決缺乏對照品的問題，能夠最大限度降低檢驗成本。

白芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall)的干燥根，性微寒，味微苦、酸。具有養血調經、柔肝止痛、斂陰止汗等功效，臨床上廣泛應用[4]。白芍主產于安徽、浙江、四川等地，其中安徽亳州種植面積最大，產量最大，也是白芍的地道產地。目前，對白芍中的化學成分和含量測定方法已研究較多，但運用一測多評法研究、評價白芍的質量相對較少[5]。本課題采用一測多評的質量評價模式，以芍藥苷為內參物，利用相對校正因子計算白芍中沒食子酸、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷和芍藥內酯苷的含量，以更簡單的方法，多指標評價白芍的質量，使其更加合理、可行。

1 儀器設備與材料

1.1 儀器設備

Agilent1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Agilent ChemStation工作站；島津 LC-20A 高效液相色譜儀，Lab solution工作站；Thermo ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、安捷倫ZORBAXSBC18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱；FA2204電子天平(常州市幸運電子設備有限公司)等。

1.2 材料

樣品：實驗用藥材樣品為課題組成員分別從安徽、浙江、四川白芍主產區采集，經亳州職業技術學院藥學院陳娜副教授鑒定為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall)的根。具體信息見表1。

對照品：沒食子酸對照品(批號：1110831-201204))、芍藥苷對照品(批號：110736-201640)、苯甲酸對照品(批號：100419-201502)，購自中國藥品生物制品研究院；芍藥內酯苷對照品(批號：17022404)、苯甲酰芍藥苷對照品(批號：20140419)購自成都普菲德生物技術有限公司。

試劑：甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 HPLC色譜條件

采用安捷倫ZORBAXSBC18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)為流動相，梯度洗脫，洗脫程序見表2。進樣量10 μL，柱溫28 ℃，流速1.0 ml/min，檢測波長為230 nm。

表1 藥材樣品信息表(n=6)

表2 洗脫程序

此色譜條件下沒食子酸、苯甲酰芍藥苷、芍藥苷、芍藥內酯苷和苯甲酸分離效果較好，理論塔板數不低于4000。結果見圖1。

2.2 樣品溶液的制備

稱取白芍樣品1 g，粉碎過2號篩，精密稱定，加入20 mL 70%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并濾液，70%乙醇定容至100 mL，搖勻，微孔濾膜濾過，即得樣品溶液。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱定芍藥內酯苷對照品13.75 mg、芍藥苷對照品22.21 mg、苯甲酰芍藥苷對照品10.64 mg和苯甲酸對照品6.6 mg、精密移取沒食子酸母液(精密稱定沒食子酸對照品15.88 mg，甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻作為沒食子酸母液)2.5 mL至50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度50 mL，得到芍藥內酯苷濃度為275 μg/mL、芍藥苷濃度為444.2 μg/mL、苯甲酰芍藥苷212.8 μg/mL、苯甲酸132 μg/mL、沒食子酸濃度為79.4 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系的考察

精密移取上述混合對照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL分別至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，制成不同濃度的對照品溶液。按2.1項下色譜條件，分別進樣，記錄峰面積。以對照品的質量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，線性回歸，得回歸方程見表3。

1.沒食子酸 2.芍藥內酯苷 3.芍藥苷 4.苯甲酸 5.苯甲酰芍藥苷圖1 白芍樣品和混合對照品的HPLC圖

成分回歸方程r線性范圍μg/mL沒食子酸y=19.018x+45.5220.99983.97～39.7芍藥苷y=3.4082x+37.8910.999622.21～222.1芍藥內酯苷y=1.8036x+25.2480.9998 13.75～137.5苯甲酰芍藥苷y=4.6754x-10.0720.9994 10.64～106.4苯甲酸y=25.378x+15.142 0.99966.6～66

2.4.2 精密度實驗

稱取安徽亳州十八里鎮白芍樣品1.0 g，按分2.2項下制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液10 μL。按上述色譜條件，進樣，測定峰面積，重復6次。分別記錄沒食子酸、芍藥內酯苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷和芍藥苷的6次峰面積，計算其RSD分別為1.32%、1.78%、1.41%、0.93%、1.48%，結果表明所使用設備精密度較好。

2.4.3 重復性實驗

分別取安徽亳州十八里鎮的白芍樣品6份，按2.2項下制備樣品溶液，按上述色譜條件，測定苯甲酰芍藥苷、苯甲酸、芍藥內酯苷、芍藥苷和沒食子酸的含量，計算RSD分別為1.21%、1.58%、1.31%、0.98%、1.07%，均小于2%，表示該方法重復性較好。

2.4.4 穩定性實驗

取十八里鎮的白芍樣品按2.2項下制備樣品溶液，按上述色譜條件，分別于0、3、6、9、12、18、24、48h進樣。記錄苯甲酰芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、芍藥內酯苷和沒食子酸的峰面積，算得RSD分別為1.19%、0.82%、1.22%、1.81%、1.73%，均小于2%，表明樣品溶液在48 h內能夠穩定存在。

2.4.5 加樣回收率實驗

取已知樣品含量的白芍樣品6份(苯甲酸芍藥苷含量為0.138%、沒食子酸含量為0.279%、苯甲酸含量為0.117%、芍藥苷含量為1.615%、芍藥內酯苷含量為0.549%)，粉碎，過2號篩，每份取0.5 g，精密稱定，分別按80%、100%、120% 三個水平，加入苯甲酸、芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷和沒食子酸5種對照品。按2.2項下制備樣品溶液，按上述色譜條件測定含量，計算加樣回收率。結果苯甲酸芍藥苷、沒食子酸、苯甲酸、芍藥苷和芍藥內酯苷苷的加樣回收率分別為101.5%、100. 4%、98.84%、99.27%和101.2%，RSD值分別為1.89%、1.72%、1.28%、0.84%和1.06%。

2.4.6 相對校正因子(RCF)和相對保留時間(RRT)的測定

取“2.2”項下混合對照品溶液1 mL,至10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，分別吸取10、20、30、40、50 μL按“2. 1”項下色譜條件進樣，測定沒食子酸、芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酸和苯甲酰芍藥苷峰面積。以芍藥苷為內參物，計算沒食子酸(X1)、芍藥內酯苷(X2)、苯甲酸(X3)和苯甲酰芍藥苷(X4)的相對校正因子(RCF)和相對保留時間(RRT)，結果見表4。表明使用不同色譜柱和不同高效液相色譜儀，各成分相對于芍藥苷的 RCF 值和 RRT 值的 RSD 均小于 5.0%，說明該方法重現性較好。

表4 白芍藥材中 4種成分的RCF和RRT(n=3)

2.5 QAMS法和外標法5種成分含量測定結果和比較

分別取白芍樣品約1g，粉碎，過2號篩，精密稱定。分別按2.2項制備方法制備樣品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，采用外標法和QAMS算出各白芍藥材中5種含量，結果見表5。

結果表明：QAMS法和外標法測定各批樣品中沒食子酸、芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷和苯甲酸5種成分含量結果相對誤差很小，均小于5%，表明兩種方法所測得含量無顯著差異。

3 討論

從表3方法耐用性考察結果可以看出，內參物芍藥苷與沒食子酸、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷和苯甲酸4種成分之間的相對校正因子重現性良好，說明QAMS法用于測定亳白芍中的5種成分，系統適用性強，方法具有可行性和可靠性。

白芍樣品的制備時，預實驗是分別摸索了回流提取和超聲提取兩種方法，并篩選了提取溶媒，結果發現超聲提取較回流提取工藝簡單，節省時間和耗材，但所得提取液相色譜出峰數多、分離度不好，故選擇回流提取。在選擇40%、70%和80%三個濃度的乙醇做提取溶劑時，實驗發現40%乙醇5種成分的含量都偏低，70%、80%的乙醇，結果差異不大，但從節省資源的角度，優選70%的乙醇做最后的提取溶劑。

表5 QAMS法和外標法測定藥亳白芍材中5種成分含量結果及比較(%，n=3)

白芍藥材5種成分檢測，一測多評法代替傳統的外標法，在沒食子酸、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷和苯甲酸對照品缺乏的情況下可以實現多成分的檢測，同時還節約了檢測成本，值得推廣應用。