松乳菇子實體人工誘導方法研究

詹少華

(皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012)

松乳菇lactariusdelicious屬于紅菇科、乳菇屬，安徽本地俗稱該食用菌為雁來菇或松菇，目前市場上的松乳菇都是采集于野外，松乳菇味道鮮美獨特，市場上價格較高，鮮菇每公斤100元左右，松乳菇季節性較強，安徽省主要在每年的初秋上市。松乳菇營養豐富，蛋白質的含量在20%以上，粗脂肪和糖類的含量品種間差異較大，脂類和總糖含量分別可達20%和15%，各類微量元素較為豐富，尤其是鈣、鐵、鋅、銅、錳含量較高。松乳菇的谷氨酸、天冬氨酸含量較高，這與松乳菇的獨特鮮味有關[1-2]。松乳菇具有很強的保健功效，松乳菇多糖具有抗腫瘤和抗炎作用[3-4]，松乳菇含有愈創木烷倍半萜類化合物，能夠清除細胞毒素和抗菌活性[5]。

松乳菇人工栽培具有較大的經濟價值，但是松乳菇完全人工栽培目前中外尚未見可信的報道。松乳菇的母種和原種制備并不困難，常見的PDA培養基就可以培養松乳菇母種和原種，麥芽糖、葡萄糖和淀粉作碳源松乳菇的菌絲都可以很好的生長[6]，維生素B1、赤霉素、三十烷醇和肌醇等物質可以促進松乳菇菌絲的生長[7]。半固體培養基松乳菇菌絲生長速度較快，可以得到棕黃色的菌絲，且可以觀察到類似子實體原基的菌絲團[8]。松乳菇在馬尾松林下半人工栽培效果并不理想，出菇數量很少[9]，松乳菇人工栽培困難較大，這與松乳菇屬于馬尾松等植物外生菌根類真菌有關[10]，人工栽培條件下，菌絲不能從松樹上獲得某類活性物質[11]。

松乳菇人工栽培是一個誘人的課題，這不僅僅是松乳菇營養價值高，經濟效益前景可觀，更重要的是為其他外生菌根菌的人工馴化提供可行性的方法，同時對研究外生菌根菌的子實體形成機理提供理論依據。近年來，本實驗室利用固體發酵原理，在培養基的成分、培養條件，尤其在培養方式方面不斷嘗試，成功誘導出松乳菇的子實體，報道如下。

1 試驗材料與方法

1.1 菌絲擴繁培養基配方

菌絲擴繁培養基配方1：蔗糖5 g、淀粉15 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀0.02 g、硫酸鎂0.01 g、氯化鈉0.5 g 、VB10.001 g、瓊脂9 g，總體積1000 ml，配制方法見參考文獻[4]。

菌絲擴繁培養基配方2：各營養成分同配方1，雜樹葉代替瓊脂，雜樹葉剪成不超過1 cm×1 cm大小，雜樹葉清水中浸泡2 h，瀝干1 h，然后依次拌入各營養成分，雜樹葉總體積1000 ml。雜樹葉來源于皖西學院校園內各類闊葉類樹葉。

菌絲擴繁培養基配方3：各營養成分同配方1，小樹枝代替瓊脂，小樹枝剪成0.5 cm×0.5 cm ×0.5 cm大小，小樹枝清水中浸泡2 h，瀝干1 h，然后依次拌入各營養成分，小樹枝總體積1000 ml。小樹枝來源于皖西學院校園內各類闊葉類植物。

1.2 子實體誘導培養基

子實體誘導培養基配方1(g/g)：托盤為20 cm×20 cm×20 cm塑料框，雜樹葉70%、棉籽殼20%、玉米粉3%、豆粕5%、蔗糖1.5%、碳酸鈣0.5%，自然pH。配制方法：雜樹葉清水中浸泡2 h，瀝干1 h，依次加入上述成分，混勻，培養基填滿整個托盤。

子實體誘導培養基配方2：托盤為20 cm×20 cm×20 cm塑料框，雜樹葉用水充分浸泡2 h，然后瀝干1 h，托盤中鋪墊5 cm厚的雜樹葉→加入上述配方1培養基10 cm→雜樹葉填滿托盤；

子實體誘導培養基配方3：托盤中間部分填充10 cm×10 cm×20 cm配方1培養基，其余部分填充雜樹葉；

子實體誘導培養基配方配方4：托盤中間部分填充10 cm×10 cm×20 cm雜樹葉，，其余部分填充配方1培養基。

1.3 子實體誘導培養條件及方法

栽培種的接種量按照培養基總量的1/10(v/v)，子實體誘導培養基中的雜樹葉不接種菌種，栽培種接種后，28 ℃、濕度70%避光培養30 d，再17 ℃、濕度80%散射光繼續培養10 d，觀察子實體誘導效果。

1.4 補料培養方法

子實體誘導成功后，在培養基上方滴加營養液10 ml，濕度60%、17 ℃培養2 d，然后再濕度85%、17 ℃培養10 d，觀察子實體發育狀況。

表1 補料營養液配方(1000 ml)

2 結果與分析

2.1 不同菌絲擴繁培養基的子實體誘導效果

表2是三種不同的菌絲擴繁培養基，分別接種到子實體誘導培養基選用配方3中，因為直徑數毫米的子實體太多，難以準確計數，且目測的方法也難以與一般的菌絲團相鑒別，所以只將子實體高度達到1 cm以上的用于計數和分析。子實體有呈現單個生長，也有簇生呈菊花狀生長(圖2)，顏色具有純白色、淡黃色或棕色。利用菌絲擴繁培養基配方1進行接種，沒有發現菊花狀的子實體，菌絲擴繁培養基配方2和配方3的子實體數量較多，但是多個子實體簇生呈菊花狀，這種菊花狀的子實體存活2天后逐漸枯萎。總體來看，菌絲擴繁培養基配方1是三種培養基中最理想的培養基。

表2 不同菌絲擴繁培養基的子實體誘導效果

圖1 子實體誘導培養基配方3中生長的子實體

圖2 子實體簇生呈菊花狀

2.2 三種子實體誘導培養基對松乳菇生長的影響

菌絲擴繁培養基選用配方1，分別接種到三種不同的子實體誘導培養基中，子實體高度達到1 cm以上的用于計數和分析。從子實體數量來看，如圖3所示，子實體誘導培養基配方4生長的子實體最多，但是菌蓋較小，菌柄較長，這種子實體繼續培養，存活2天后枯萎。子實體誘導培養基配方2和配方3培養的松乳菇，菌蓋較大，菌柄較短，繼續培養可以5天以上，子實體誘導培養基配方1生長的子實體，子實體數量少且細長，總體來看子實體誘導培養基配方3是最理想的培養基。

表3 三種子實體誘導培養基對松乳菇子實體誘導效果的影響

2.3 補料營養液對松乳菇子實體發育的影響

菌絲擴繁培養基選用配方1，子實體誘導培養基選用配方3，5種補料營養液的區別在于蛋白胨含量的區別，也就是碳氮比的不同。表4表明，各種補料營養液都可以提高子實體的成活率，補料營養液配方4對原有子實體的生長作用最理想，主要表現為無衰退子實體比例最高，同時菌柄較短，菌蓋較大，子實體的顏色接近野生松乳菇的顏色。補料培養過程中，補料營養液配方3更有利于新子實體的產生。

圖3 子實體誘導培養基配方4生長的子實體

對照配方1配方2配方3配方4配方5原有子實體無衰退的比例/%2.76.317.223.535.631.3顏色淡黃色淡黃色淡黃色棕黃色棕黃色棕黃色菌柄長度/cm3.73.63.12.82.61.9菌蓋直徑/cm1.21.31.71.92.32.1新生子實體數量/個813271276756顏色淡黃色淡黃色淡黃色棕黃色棕黃色棕黃色菌柄長度/cm3.73.62.80.91.71.9菌蓋直徑/cm0.40.40.50.80.50.7

圖4 補料培養得到的松乳菇子實體

3 討論

本試驗表明松乳菇在完全脫離松樹環境下，在實驗室里可以誘導出松乳菇的子實體，這說明松乳菇人工栽培完全可行，以前未發現這方面可信的報道，方平夷采用棉籽殼培養基[12]，室內自然條件下培養，該文獻報道說觀察到了松乳菇的子實體，從該文的子實體誘導培養基配方來看，棉籽殼90%，腐爛茅草8%，蔗糖2%，該培養基無水分，本實驗室重復該實驗，發現該培養基連松乳菇的菌絲都不能生長，該實驗沒有對松乳菇培養的濕度進行控制，任何食用菌都難以形成子實體。

菌絲擴繁培養基是一種半固體培養基，半固體培養基作為菌絲擴繁培養基是誘導松乳菇子實體的關鍵因素之一，而其他培養基培養松乳菇菌絲時，往往產生較多的菌絲分泌物，這些分泌物又抑制了菌絲進一步的生長和分化。

子實體誘導培養基的設計依據來源于我們對野生松乳菇生長環境的觀察，在野生條件下，松乳菇生長在雜樹葉的腐質土環境中，松乳菇可以利用雜樹葉作為碳源，所以子實體誘導培養基是以雜樹葉為主要原料，同時在子實體培養基添加豆粕等原料補充氮源。雜樹葉在子實體誘導方面起到了重要作用，子實體誘導培養基配方3是最理想的培養基，這與該培養基中四周具有雜樹葉覆蓋有關，松乳菇菌絲生長具有攀爬支持物的特點，這樣菌絲可以生長更長，產生更多的分支，雜樹葉之間的空隙菌絲生長密集，有利于菌絲之間扭結到一起產生子實體原基，松乳菇的原基多數生長在雜樹葉上，尤其是在葉脈處松乳菇的原基較多，雜樹葉還有保濕作用，提供菌絲生長和產生原基的微環境。

補料培養有利于子實體的繼續發育，這可能是因為補料培養提供了新的營養液，但是我們觀察發現，子實體形成時，培養基中的豆粕等物質還大量存在，培養基中的營養物質還有很多沒有被消耗，補充新的營養液，促進子實體的生長，還可能因為補料營養液改變了培養基的酸堿度等因素。本試驗補料培養研究表明，松乳菇的子實體形成和子實體進一步發育可能需要不同的培養基，這是在其他食用菌栽培過程中沒有發現的現象。

本試驗得到的松乳菇子實體菌蓋最大直徑約4 cm，而野生的松乳菇菌蓋直徑可達到10 cm以上，這說明松乳菇人工栽培尚需進一步探索，下一步研究的重點是松乳菇子實體不同發育階段的培養基和培養條件。