1株肉種鴨源金黃色葡萄球菌分離鑒定與藥敏試驗

申紅春

(恩施職業技術學院 ， 湖北恩施445000)

葡萄球菌屬于微球菌科中葡萄球菌屬，該菌廣泛分布在自然界中，可以引起雞、鴨、鵝、火雞、豬、兔等多種家禽、家畜發病，為臨床中重要人獸共患病病原菌。鴨葡萄球菌病是由金黃色葡萄球菌引起鴨的一種急性或慢性傳染病總稱，該病可以感染不同品種、不同日齡的鴨，臨床上主要表現急性敗血癥、關節炎、腱鞘炎、腳墊腫等，其中雛鴨最易感，主要表現急性敗血癥，死亡率較高，當育成鴨和種鴨感染后，一般呈慢性經過，主要表現關節炎、腱鞘炎、腳墊腫等癥狀，該病對種鴨危害較嚴重，成為引起種鴨死淘率較高的重要疾病之一。

2018年6月，恩施地區某肉種鴨規模化養殖場，12周齡的肉種鴨出現采食減少、精神沉郁、兩翅下垂、縮頸，肉種鴨出現關節腫大，不敢站立，跛行或跳躍式步行，在出現癥狀3～5天后開始死亡，個別肉種鴨不表現任何的癥狀突然死亡。無菌采集死亡肉種鴨的肝臟、心血、關節滲出液等病料組織中分離到單一病原菌，被鑒定為金黃色葡萄球菌，因此，對從肉種鴨體內分離到金黃色葡萄球菌進行了致病性檢測和藥敏試驗，為該病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2018年6月，恩施地區某肉種鴨規模化養殖場中死亡的12周齡的肉種鴨，無菌采集死亡肉種鴨的肝臟、心血、關節滲出液等病料組織。

1.2 主要試劑與儀器 藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術開發公司；綿羊血培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基、普通營養培養基、營養肉湯，均購自青島高科園海博生物技術有限公司； Raid ID 32 STREP 陽性菌鑒定試紙條，購自Bio-Merieuxsa公司； DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix，均購自北京康為世紀生物科技有限公司；PCR儀由德國Eppendorf 公司生產；隔水式恒溫培養箱由自上海一恒科技儀器有限公司生產。

1.3 試驗動物 12周齡健康肉種鴨10只，由恩施地區某肉種鴨規模化養殖場提供，飼養于恩施職業技術學院實驗動物中心。

1.4 分離與培養 無菌采集死亡肉種鴨的肝臟、心血、關節滲出液等病料組織劃線接種于綿羊血培養基上，37 ℃培養12～18 h，挑取單個優勢菌落接種于甘露醇氯化鈉培養基上，37 ℃培養12～18 h。挑取單個菌落分別接種于普通培養進行純化培養，并對純化培養的分離菌株進行染色鏡檢。

1.5 生化鑒定 用比濁儀調整分離菌株菌液濃度為2個麥氏濁度，并接種于Raid ID 32 STREP 陽性菌鑒定試紙條中，37 ℃恒溫培養24～48 h，用ATB型自動化微生物生化鑒定系統測定分離菌株的生化特性。

1.6 16S rRNA PCR鑒定 利用水煮法提取分離菌株的基因組DNA，用細菌16S rRNA通用引物5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′(由華大基因生物工程公司合成)對分離菌株進行PCR擴增。PCR擴增反應體系為50 μL：2×TaqMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環，72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠檢測分離菌株的目的條帶， 將PCR產物送華大基因生物工程公司進行基因序列測序，測序結果與GenBank數據庫中登錄基因序列進行同源性比較。

1.7 致病性試驗 取純化培養的分離菌株接種于營養肉湯中培養至對數期后，用菌落計數法計數，調整菌液濃度為106CFU/mL。試驗組每只腹腔注射0.5 mL(106CFU/mL)，對照組給予等量的生理鹽水，試驗組在攻毒12 h后，觀察7 d，記錄其發病情況和死亡情況。

1.8 藥敏試驗 參照美國美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)推薦的標準K-B紙片法進行試驗操作和結果判斷。

2 結果

2.1 細菌分離培養鑒定結果 分離菌株在綿羊血培養基上生長出邊緣整齊的、圓形的、光滑的、帶透明的溶血環菌落，呈現β溶血；在甘露醇氯化鈉瓊脂培養基上生長出圓形的、大小一致的、淺黃色或者米黃色的菌落；在普通培養基上生長出圓形的、白色的菌落，延長培養時間，白色的菌落變成金黃色的菌落；染色鏡檢可見單個短鏈和成堆的葡萄串狀排列的陽性球菌。與報道的金黃色葡萄球菌的培養特性和形態學一致。

2.2 細菌生化鑒定結果 分離菌株V-P試驗和過氧化氫酶試驗陽性，靛基質試驗陰性，分解葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖，且產酸不產氣；分解馬尿酸鹽、還原硝酸鹽、精氨酸；不分解纖維二糖、阿拉伯糖、并水解淀粉、七葉苷，不產生H2S。ATB全自動生化鑒定系統中鑒定為金黃色葡萄球菌，評定合格率為99.9%。與報道的金黃色葡萄球菌的生化特性一致。

2.3 細菌16S rRNA PCR鑒定結果 分離菌株用細菌16S rRNA通用引物擴增出大約為1 492 bp左右的目的基因的條帶(見圖1)，分離菌株的PCR產物測序結果與GenBank中登錄的參考株10株金黃色葡萄球菌參考株的基因序列同源性為在99.9%～100.0%之間，從分子生物水平證實了分離菌株為金黃色葡萄球菌。

2.4 致病性試驗 試驗組肉種鴨攻毒后的2～3 d，出現了精神沉郁、食欲減退、呆立，3只肉種鴨出現死亡，至到4 d，試驗組的肉種鴨死亡率100%；剖檢死亡的肉種鴨，從無菌采集病料組織中分離到金黃色葡萄球菌。對照組肉種鴨無明顯的癥狀，因而證實了分離到金黃色葡萄球菌對肉種鴨具有很強的致病性。

圖1 分離菌株16S rRNA PCR鑒定結果

M:DL-2 000 Marker ; 1～2:分離菌株

2.5 藥敏試驗 由表1可知，分離菌株對頭孢曲松、頭孢噻肟、環丙沙星、慶大霉素、氟苯尼考5種藥物敏感；對氨芐西林、恩諾沙星、卡娜霉素、阿米卡星4種藥物中敏；對青霉素、阿莫西林、強力霉素、林可霉素、大觀霉素5種藥物耐藥。

表1 藥敏試驗結果

S：敏感，I：中敏，R：耐藥

3 討論

葡萄球菌根據脂溶性色素的生化反應可以分為腐生葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌3類型，其中金黃色葡萄球菌是引起肉種鴨葡萄球菌病的主要病原菌，該病一年四季均可發生，在高溫、多雨的季節或潮濕時節較為多發，其感染率和死亡率均較高，成為危害養鴨業主要細菌性疾病之一[1]。金黃色葡萄球菌可以分泌20多種毒性蛋白質，該菌的致病性與其分泌或者產生的毒素和侵襲性酶均有一定相關性，該菌可以引起化膿性疾病和毒素性疾病兩類疾病[2]。金黃色葡萄球菌攜帶多種致病因子，α-溶血素主要毒力因子之一，可以產生毒素，并在金黃色葡萄球菌的致病和逃避機體免疫抑制過程中發揮重要的作用，β-溶血素是該菌的主要致病因子之一，具有溶解紅細胞的特性，金黃色葡萄球菌溶血性與致病性密切相關[3]。近年來，關于鴨葡萄球菌病的發病呈現上升的趨勢，應引起重視。

本試驗從病死的肉種鴨體內分離到了1株金黃色色葡萄球菌，通過人工感染肉種鴨驗證其致病性，結果表明，分離到的一株金黃色葡萄球菌對肉種鴨致死率為100%。從而證實了金黃色色葡萄球菌是引起肉種鴨發病的主要病原菌。金黃色葡萄球菌菌的主要通過創傷傳播，也可通過消化道、呼吸道和臍帶感染，其中病禽和帶菌家禽是該病主要的傳染源，當通風不良、擁擠、斷喙、刺種疫苗、網刺等飼養管理不當也可以引起該病發生與流行。在肉種鴨養殖過程中引起注意[1,4]。由于金黃色色葡萄球菌抗原結構復雜，沒有理想的疫苗，抗生素成為該病主要治療手段。本試驗藥敏試驗結果顯示，分離菌株對頭孢曲松、頭孢噻肟、環丙沙星等5種藥物敏感；對氨芐西林、恩諾沙星、卡娜霉素等4種藥物中敏；對青霉素、阿莫西林、強力霉素等5種藥物耐藥。當肉種鴨發生該病時，應通過藥敏試驗選擇敏感的藥物，合理使用，提高治療療效，減少耐藥性產生。同時加強平時的飼養管理，注意環境中消毒。