副豬嗜血桿菌的分離鑒定及三價滅活疫苗免疫效力分析

高日明 ， 范秀麗 ， 李玉安 ， 李甜甜 ， 范 娟 ， 關平原 ， 楊漢春

(1.中國農業大學動物醫學院 ， 北京海淀100193 ； 2.金宇保靈生物藥品有限公司 ， 內蒙古呼和浩特010030 ； 3.揚州優邦生物藥品有限公司 ， 江蘇揚州225008 ；4.內蒙古農業大學獸醫學院 ， 內蒙古呼和浩特010018)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，H.parasuis)主要引發豬的多發性漿膜炎、腦膜炎和關節炎。H.parasuis是最常見的繼發性感染菌之一，臨床上常繼發于PRRS和PMWS[1]，主要引起4～12周齡仔豬發病，且抗生素對其治療效果不顯著，給我國養豬業帶來了巨大的經濟損失。截至目前，H.parasuis已有15個血清型被確定，但仍有部分菌株尚未確定血清分型。許多臨床分離株已經鑒定，且血清型4、5、12、13型和14型被認為是我國當前流行的主要H.parasuis[2-3]。

臨床上抗生素的廣泛使用造成了耐藥性的H.parasuis不斷產生，給該疾病的控制帶來了巨大的挑戰。疫苗免疫仍被認為是當前防控格拉澤病重要手段且能預防耐藥性的產生[4]。有報道表明，含有重組轉鐵結合蛋白B(TbpB)、富含TbpB的外膜蛋白及OMP2或D15及來自OMP的PalA和HPS-06257的亞單位疫苗對HPS攻毒只能提供部分保護[4-6]。當前，H.parasuis血清1型、4型、5型及血清6型的部分菌株分別作為商業滅活疫苗已在中國、美國和西班牙廣泛使用，在該病的預防上發揮著重要的作用[7]。

本研究于2009年至2016年期間分別采集華東地區45個發病豬場發病豬或瀕死豬病料進行細菌分離。首先對分離株的16S rRNA基因進行PCR初步鑒定，隨后對鑒定的陽性分離株進行血清型鑒定，根據優勢流行不同血清型各菌株制備了副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗，并對該疫苗的免疫效力進行了評估，攻毒試驗結果表明，該疫苗可有效抵抗對應血清型強毒株的攻擊，為多價副豬嗜血桿菌的疫苗研制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 病料來源 揚州優邦生物藥品有限公司2009年至2016年分別從華東地區45個豬場發病豬只139頭發病豬采集453份病料(包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟、心包積液、胸腔積液、關節積液)。

1.2 試劑背景 TSB培養基，購自美國BD (Becton, Dickinson and Company)公司；Rehydragel系列鋁膠佐劑，購自美國通用化學(General Chemical)公司；新生牛血清，購自杭州四季青生物有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；無菌脫纖綿羊血，購自南京便診生物科技有限公司；生化微量鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司。H.parasuis4型、5型和12型標準陽性血清由東北農業大學饋贈，標準陰性血清為HSP抗原、抗體檢測均為陰性健康仔豬血清。副豬嗜血桿菌凝集抗原制備方法參照王建學位論文[8]。

1.3 方法

1.3.1 副豬嗜血桿菌分離、培養與純化 從采集的豬病料(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、心包積液、胸腔積液、關節積液)中無菌取樣并接種TSA，置于37 ℃、5% CO2中培養24～48 h，觀察結果。挑取圓形、光滑、濕潤和無色透明的可疑菌落，再次接種TSA、巧克力瓊脂平板、兔鮮血瓊脂平板及普通營養瓊脂平板，反復進行2～3次純化，直到無雜菌為止。

1.3.2 分離株染色和鏡檢 挑取TSA瓊脂培養基上生長細小、透明、露珠狀疑似菌落涂片，革蘭染色鏡檢，顯微鏡下觀察細菌的形態特征。

1.3.3 生化鑒定 挑取已純化單菌落分別接種相應的生化鑒定管(含2 μg/mL NAD)，于37 ℃、5% CO2中培養48 h后，觀察結果。

1.3.4 血清分型 將經鑒定為H.parasuis的菌株送至揚州大學農業部禽用生物制劑創制重點實驗室利用玻板凝集法進行血清學分型[9]。

1.3.5 分離菌株Omp P5 基因擴增與鑒定

1.3.5.1 引物設計 參照Oliveira 等[10]的報道合成引物。16S rRNA基因引物序列為上游引物P1為5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′，下游引物P2為5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′，預期擴增片段大小為821 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3.5.2 PCR鑒定 取分離株培養菌液離心收集菌體加PBS重懸后沸水浴10 min，12 000 r/min離心，取上清獲得分離株基因組。PCR 反應體系(25 μL)：MixTaq12.5 μL，上游引物P1(10 pmol/μL) 0.5 μL，下游引物P2(10 pmol/μL) 0.5 μL，基因組模板2 μL。進行PCR反應，反應結束進行1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結果。

1.3.5.3 副豬嗜血桿菌分離株對BALB/c小鼠的致病性試驗 將240只BALB/c小鼠隨機分成24組，每組10只，設置23組為H.parasuis攻毒組，1組為PBS對照組。4～1至4～6共6組均攻擊4型菌株(2.5×109CFU/只)，5～1至5～9共9組均攻擊5型菌株(2.5×109CFU/只)，12～1至12～8共8組均攻擊12型菌株(2.5×109CFU/只)，對照組腹腔注射等量PBS，攻毒后14 d觀察小鼠死亡情況。

1.3.6 副豬嗜血桿菌三價滅活疫苗的制備 取分離株中篩選出的4型SH株、5型GD株和12型JS株劃線接種于TSA平板，37 ℃培養24～48 h，挑取單個菌落接種于TSB液體培養基培養12 h進行細菌計數，使3種血清型的細菌濃度達2.5×1010CFU/mL，等體積混合，加入終濃度為0.2%甲醛，于37 ℃、100 r/min滅活24 h，與鋁膠佐劑1∶5混合，制成鋁膠滅活疫苗。

1.3.7 疫苗免疫效力評估

1.3.7.1 副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗免疫豬血清抗體檢測 將20頭14日齡的健康仔豬設置為免疫組(免疫/攻毒組)，并設置15頭陰性對照組。免疫組頸部肌肉注射2.0 mL副豬嗜血桿菌3價滅活疫苗，首免21 d后以相同劑量加強免疫1次，對照組以相同免疫程序注射2.0 mL PBS。首免后分別在1、2、3、4周和5周時采血并分離血清，利用微量凝集法測定針對3種不同血清型副豬嗜血桿菌抗體效價觀察凝集現象并判定結果。

1.3.7.2 疫苗免疫仔豬的攻毒試驗 二免2周后對所有免疫組和未免疫組進行腹腔注射攻毒，免疫組按照5頭/組隨機分為四組，其中三組分別腹腔注射4型SH株(2×1010CFU/頭)、5型GD株(5×109CFU/頭)和12型JS株(5×109CFU/頭)，剩下一組為免疫/不攻毒組，腹腔注射等體積的PBS，未免疫/攻毒對照組隨機分為三組(每組5頭)，攻毒后，每日測量體溫，并觀察感染豬的臨床表現及死亡情況，連續觀察14 d，對死亡豬進行剖檢并觀察病理變化。

2 結果

2.1 分離菌株的形態與培養特性 34株分離株在TSA平板上均呈光滑圓潤、無色或灰白色的小型菌落，革蘭染色后鏡檢顯示為革蘭陰性小球桿菌。

34株分離株在含NAD和血清的TSA平板上能正常生長，在含NAD和綿羊鮮血TSA瓊脂平板上生長狀態最好，而在S、S、麥康凱和不含NAD的TSA瓊脂平板上皆不生長。

2.2 分離菌株對BALB/c小鼠的致病性 如表1所示，相同攻毒劑量的不同血清型菌株可導致小鼠不同的致死率，且同一血清型的不同分離株致死率也不盡相同。具體如下，血清4型菌株致病力不同，SH1012株毒力最強，死亡率為5/10；血清5型菌株致病力皆比較強，致死率皆在5/10以上，其中GD1022株毒力最強，死亡率可達9/10；血清12型菌株致病力均較強，小鼠死亡率大于4/10，其中JS1015株毒力最強，可導致7/10小鼠死亡。

表1 不同血清型副豬嗜血桿菌分離株對BALB/c小鼠的致病性

2.3 生化鑒定 對27株已確定血清型的H.parasuis分離株進行生化鑒定，將細菌純培養物接種于生化微量鑒定管中，37 ℃培養，生化鑒定結果表明，分離株均能發酵葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、果糖和木糖，對尿酶、硫化氫、硝酸鹽和吲哚試驗反應均呈陰性，均具有NAD依賴性，結果與H.parasuis的生化特性相符。

2.4 血清分型 將34株分離株進行血清分型，其中6株血清4型(17.65%)、9株血清5型(29.41%)、8株血清12型(29.41%)、4株血清13型(11.76%)以及7株未定型菌株(表2)，結果表明，我國目前流行的HPS以4型、5型及12型血清型為主。

表2 34株分離株信息

2.5 PCR鑒定 以分離株的DNA作為模板,以16S rRNA為特異性引物進行PCR擴增，凝膠電泳結果顯示，從所分離的34株副豬嗜血桿菌均能擴增得到約821 bp大小的特異性條帶，與預期一致。

2.6 疫苗免疫仔豬血清抗體檢測 取14日齡的健康仔豬15頭為免疫組，并設置15頭陰性對照組。免疫組頸部肌肉注射2.0 mL上述副豬嗜血桿菌三價滅活疫苗，首免21 d后進行加強免疫，免疫劑量和免疫方式與首免相同，對照組以相同的免疫方式注射2.0 mL PBS。分別在首次免疫后1、2、3、4、5周時對其采血并分離血清，利用微量凝集法測定針對3種血清型副豬嗜血桿菌抗體效價，計算每組的平均效價，結果如圖1所示，副豬嗜血桿菌3價滅活疫苗免疫后1周并未檢測到針對4型、5型及12型副豬嗜血桿菌抗體效價。從免疫后第2周開始，抗體效價逐漸增長，其中針對4型和12型副豬嗜血桿菌抗體效價分別于對照組相比差異極顯著(P<0.001；P<0.01)。自首免后第3周開始，針對3種血清型副豬嗜血桿菌抗體效價顯著提高，均與對照組差異極顯著(P<0.001)。

圖1 仔豬首免后5周血清中各血清型的微量凝集價

2.7 疫苗免疫仔豬對攻毒的保護效果 疫苗免疫保護力結果表明(如表3所示)3價副豬嗜血桿菌滅活疫苗對SH株和JS株可以提供5/5免疫保護，對GD株可以提供4/5免疫保護，而不免疫/攻毒組針對3個H.parasuis分離株分別出現了4頭、5頭和4頭豬只死亡，死亡率分別為4/5、5/5和4/5，免疫/不攻毒組的豬則全部存活。綜上，3價滅活疫苗可有效提供針對3株不同血清型毒株免疫保護力。

表3 3價副豬嗜血桿菌滅活疫苗免疫效力試驗

2.8 仔豬攻毒后臨床癥狀和病理變化 攻毒后80%仔豬呈現明顯的臨床癥狀，主要表現為體溫升至40.5 ℃以上，咳嗽，呼吸困難，關節腫脹，消瘦，跛行。剖檢病理變化主要表現為腹腔積液、胸腔纖維液滲出、心包積液、心包積厚和粘連、腹腔纖維滲出和粘連及關節腔炎性滲出，而未攻毒對照組無異常臨床表現。

3 討論

本試驗共分離34株H.parasuis，其中，6株血清4型(17.65%)、10株血清5型(29.41%)、10株血清12型(29.41%)、4株血清13型(11.76%)，表明血清4型、5型和12型副豬嗜血桿菌是我國流行的血清型，與之前報道的結果相符[11-13]。

以H.parasuis為病原的格拉澤病引發豬的高發病率和高死亡率，給我國生豬養殖帶來了重大的經濟損失。當前，有效的商業疫苗還不能對所有血清型的H.parasuis帶來交叉保護[13-14]。有報道表明，血清4型和5型副豬嗜血桿菌滅活疫苗可以減少由4型、5型、13型和14型H.parasuis感染所引起的死亡率和臨床癥狀，但其并不能保護我國主要流行的12型HPS感染[7]。因此，制備能夠保護4型、5型和12型H.parasuis感染的3價滅活疫苗十分必要。

本研究以篩選出的4型SH1012株、5型GD1022株和12型JS1015株作為制備副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗的候選菌株，并進行仔豬攻毒保護試驗，結果顯示，仔豬二免3價疫苗后顯著提高針對H.parasuis4型、5型、12型的血清效價，且顯著降低各血清型H.parasuis強毒攻毒時發病率和死亡率。表明該3價副豬嗜血桿菌滅活疫苗具有較好的免疫原性，可以抵抗對應血清型H.parasuis強毒的攻擊，具有較好臨床推廣前景。