姜黃揮發油對禽致病性大腸桿菌的藥敏試驗

潘百明 ， 何彩梅 ， 梁昌祥 ， 韋學豐 ， 周慧玲

(賀州學院食品與生物工程學院 ， 廣西賀州542899)

禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌引起的一種傳染病，該病存在于世界各地的家禽中，引起心包炎、肝周炎、氣囊炎、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、大腸桿菌性肉芽腫和臍炎等病變，嚴重時會導致發病家禽出現敗血癥和死亡；禽致病性大腸桿菌存在多種血清型，對多種抗生素、磺胺類和呋喃類藥物都敏感，但極易產生耐藥性。本文在10個集約化養雞場分離出10個禽致病性大腸桿菌菌株，選用6種較為敏感(近期曾做過試驗)的抗生素做對照，用姜黃揮發油做藥敏試驗，尋找中藥防治禽大腸桿菌病的方法。

姜黃別名毛姜黃、郁金，為姜科多年生草本植物；姜黃最主要的兩個活性成分為姜黃素及姜黃揮發油，是一種可以藥食兩用的植物香料[1]，據國內外的相關研究報告，姜黃揮發油對致病性菌均有一定的抑菌活性[2]，對大腸桿菌等具有抗菌活性，對金黃色葡萄球菌等作用較為明顯[3]。本試驗采用超聲波輔助提取法提取姜黃揮發油，對病禽分離出來的致病性大腸桿菌進行藥敏試驗，為有效防治禽大腸桿菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 姜黃片 購自賀州學院東區后門旁的瑞康藥店，產地為廣西，由安徽人民中藥飲片有限公司生產。

1.1.2 試驗菌 由賀州學院微生物學實驗室分別從10個不同鄉鎮集約化養雞場病雞分離，根據病理變化、鏡檢、細菌培養特性和生理生化試驗，鑒定為致病性大腸桿菌。

1.1.3 藥敏試紙 杭州天和微生物試劑有限公司的藥敏紙片。

1.1.4 主要儀器 超聲波儀(JY98-3D)：寧波新藝生物科技股份有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-100SⅡ)：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；循環水式多用真空泵(SHZ—DⅢ)：河南省予華儀器有限公司；電子分析天平(FA2004)：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；電熱培養箱恒溫(DHP-9082)：上海齊欣科學儀器有限公司；雙人雙面凈化工作臺(SW-CJ-2F)：蘇州凈化設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 姜黃揮發油的提取 參照宋曰欽[4]等的提取方法提取姜黃揮發油，將姜黃片于粉碎機粉碎后，分別稱取3份30 g的姜黃粉末過30目的標準篩后置于洗凈干燥的三角瓶中，按1∶10的比例分別量取300 mL的石油醚于瓶里，分別放在超聲波清洗器里，設置溫度為20 ℃～30 ℃，功率為100 w，時間為30 min；經過超聲波處理后，抽濾，將濾液放在圓底燒瓶中，使用旋轉蒸發儀來濃縮濾液，溫度控制在60 ℃，直至冷凝管無液體滴落，產品在蒸餾瓶里，收集瓶里回收石油醚；將蒸餾瓶倒置在洗凈干燥后的小燒杯里，里面的油會緩慢流下來，靜置30 min，將3次所收集的揮發油混合放一起得到橙黃色的油狀的液體，避光保存備用。經測定姜黃揮發油的含量為7%。

1.2.2 姜黃揮發油的配制 將以上的揮發油用1%吐溫-80水溶液溶解并配制姜黃揮發油溶液的濃度為200 mg/mL、100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL的溶液。

1.2.3 藥敏試驗

1.2.3.1 姜黃揮發油抑菌濃度的選擇 取自病雞分離出來的大腸桿菌菌株，在無菌操作下于營養瓊脂平板以劃線方式將細菌均勻涂布到整個平板上；將牛津杯輕輕地放在平板上，將姜黃揮發油溶液慢慢倒入牛津杯，不可溢出，每個平板上放3個牛津杯，將各個濃度梯度做好標記，放置于恒溫培養箱37 ℃，培養24 h。

1.2.3.2 姜黃揮發油對10個菌株的藥敏試驗 選用平時做過藥敏試驗較為敏感的環丙沙星、慶大霉素、丁胺卡那霉素、氟本尼考、多西環素、頭孢噻肟等6種抗生素和姜黃揮發油對10個不同大腸桿菌菌株做藥敏試驗，6種抗生素按藥敏紙片法做藥敏試驗，培養基為普通營養瓊脂；姜黃揮發油采用牛津杯法做藥敏試驗，選擇(1.2.3.1試驗)最佳濃度為25 mg/mL的姜黃藥物濃度，判斷標準見表1。

表1 藥敏實驗判定標準

2 結果與分析

2.1 姜黃揮發油抑菌濃度 見表2。

表2 姜黃揮發油在不同的濃度下的抑菌情況

由表2可知，25 mg/mL姜黃揮發油濃度抑菌效果已達到高敏，大于此濃度的50 mg/mL、100 mg/mL和200 mg/mL 3個濃度均為高敏，因此在使用姜黃揮發油防治大腸桿菌病時并不是濃度越高越好，本試驗只設定200 mg/mL、100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL 6個姜黃揮發油濃度，試驗結果25 mg/mL濃度為最低抑菌(高敏)濃度，超過該濃度反而造成藥物浪費；小于該濃度的對大腸桿菌病達不到治療效果。

2.2 姜黃揮發油(25 mg/ /mL)對10株大腸桿菌的藥敏結果 見表3。

表3 姜黃揮發油及6種抗生素對10株大腸桿菌的藥敏結果

從表3可以看到，10株大腸桿菌對姜黃揮發油均敏感，其中9株達到高敏；而6種抗生素有3種存在不同程度的耐藥性，這3種抗生素口服用藥比較方便，市場比較普遍，這可能在場內常用導致；較敏感的3種抗生素中，敏感性也存在差異，其中頭孢噻肟有產生耐藥的趨勢，如果長期使用會產生耐藥性。

3 討論

本試驗結果表明，姜黃揮發油對致病性禽大腸桿菌具有高度的敏感性，可以用于預防和治療禽大腸桿菌病；姜黃揮發油濃度為25 mg/mL，抑菌圈最大，抑菌作用較好，具有抑殺禽大腸桿菌的作用；可長期用作大腸桿菌病的治療藥物和預防保健藥物；由于大腸桿菌存在多種血清型，極易產生耐藥性，開發姜黃藥劑對于預防和治療禽大腸桿菌病有很重要的意義；集約化養雞場可以嘗試姜黃與抗生素配合使用，減少耐藥性的產生，也可以用姜黃粉碎拌入飼料進行預防，減少和預防禽大腸桿菌病的發生。