寵物園犬腹瀉病原的分子鑒定分析

張學勇 ， 簡瑩娜 ， 李秀萍 ， 王戈平 ， 蔡其剛 ， 王光華 ， 馬利青

(1.青海大學畜牧獸醫科學院 省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室 ， 青海西寧810016 ；2.青海省畜牧獸醫科學院 ， 青海西寧810016)

寵物犬作為現代生活中重要的伴侶動物，越來越受到人們的喜愛，但是犬的疾病特別是腹瀉疾病及其引起的其他癥狀，嚴重時可導致犬死亡，嚴重危害養犬業的健康發展；同時，犬攜帶的一些人獸共患性病原，隨著犬的活動及其與人們的親密接觸，也是一個重要的公共衛生問題，所以有必要對其主要病原進行有效的確診鑒定。目前，雖然臨床上治療犬腹瀉的藥物很多，但是多數情況下卻簡單采用抗生素類藥物治療，有時不能做到有效治療；同時獸醫臨床中缺少必要的實驗室診斷方法，不能準確診斷出致病性的各種病原。引起犬腹瀉的主要病原有細菌性病原、病毒和寄生蟲病原，細菌菌群為腸道內常在菌，故本文未對細菌(主要是大腸桿菌和沙門菌)進行檢測鑒定；寄生蟲性病原有線蟲、鉤蟲、蛔蟲、絳蟲、球蟲、隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲等；病毒性病原主要有犬瘟熱、犬細小病毒病、犬傳染性肝炎、犬冠狀病毒和犬輪狀病毒感染等。此寵物園犬只均進行了疫苗接種和藥物驅蟲。

本研究通過對腹瀉性疾病的犬糞便樣品進行PCR分子鑒定，確診引起犬腹瀉的主要病原，針對性地對病毒性和寄生蟲性病原，合理采用對癥治療、對因治療和輔助支持治療方法進行全面有效的救治預防，以期為臨床上有效防治犬腹瀉提供科學參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品 按照采樣要求，對有多次腹瀉癥狀的犬，觀察其糞便狀態、顏色及無明顯膿血等癥狀的樣品進行采集，無菌收集新鮮糞便1 g左右，放于保存液中冰盒及時運至實驗室進行分析。

1.2 主要試劑與儀器 PremixExTaq和DNA Marker DL-2 000均購自寶生物工程(大連)有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒自購自天根生化科技(北京)有限公司；病毒RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒，購自凱杰(Qiagen)生物技術有限公司；PCR引物合成及PCR產物測序均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，其他均為國產常規試劑。主要儀器包括PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統等。

1.3 基因組DNA和病毒RNA的提取 利用天根生化科技(北京)有限公司糞樣DNA提取試劑盒對糞樣進行基因組DNA的提取，利用Qiagen病毒RNA提取試劑盒提取糞樣中的病毒RNA，具體的操作步驟均參考試劑盒說明書進行。

1.4 PCR分子鑒定分析 參照反轉錄試劑盒將提取的病毒總RNA反轉錄得到cDNA，依次為模板進行PCR擴增；PCR引物序列及其相關信息詳見表1；PCR擴增酶為寶生物工程(大連)有限公司的PremixTaq酶，擴增反應體系如下：PremixTaq25.0 μL，上下游引物(濃度10 μmol/L)各2 μL，模板DNA3 μL，補充水18 μL 至PCR反應體系為50 μL。擴增后PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳(電壓120 V， 時間30 min)，電泳完成后在凝膠成像儀中觀察結果并拍照。測序結果經峰圖分析后，在GenBank上用采用BLAST方法進行同源序列搜索，應用MEGA 5.0軟件和Clustal Omega在線軟件進行核苷酸序列和氨基酸序列同源性的分析。

表1 犬腹瀉相關病原的PCR分子鑒定所用引物

2 結果與分析

基于隱孢子蟲18S rRNA 基因進行PCR擴增出約587 bp的目的片段(如圖1A)，4(4/18)例隱孢子蟲陽性均為犬隱孢子蟲(Cryptosporidiumcanis)。基于賈第鞭毛蟲β-giardin 基因進行PCR擴增出約511 bp的目的片段(如圖1B)，6(6/18)例賈第鞭毛蟲陽性的基因型包括Giardiaintestinalisassemblage B(n=1)、C(n=2)和D(n=3)。基于犬瘟熱病毒CDV-H基因，未擴增到目的片段；基于犬細小病毒CPV-VP基因進行PCR擴增出約568 bp的目的片段(如圖1C)，犬細小病毒陽性為CPV2型(18/18)。

3 結論與討論

犬腹瀉的致病因素很多且非常復雜，這個寵物園的18只患犬主要是病原感染引起的腹瀉，包括病毒性感染(100.0%)腹瀉和寄生蟲性感染(44.4%)，可見犬只均為帶毒帶蟲的隱性感染狀態。本次通過對病犬的糞便進行病原性診斷，發現病毒性腹瀉主要由犬細小病毒引起，癥狀明顯且死亡率高[5]；寄生蟲性腹瀉常由隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲等引起[6]。本次患病犬只均在寵物園飼養管理下生長，疫苗預防和營養保健管理可視為相同，生活環境相同，故不考慮環境應激和飼養管理。犬只腹瀉的原因是由多種病原相互作用引起的，大腸桿菌菌群常在腸道存在且處于生態平衡狀態；隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲也為條件性致病性原蟲；當犬只的免疫力下降，機體環境變化而菌群失調時，腹瀉病就暴發了，此次誘因是感染了犬細小病毒。堅持預防為主、治療為輔的原則，實施“防重于治”的方針，按時按程序進行犬只的傳染病疫苗免疫，提高免疫力。準確鑒別診斷病原尤為重要，這樣才能為采取對因治療、對癥治療和輔助支持療法措施提供科學依據。

圖 1 各病原檢測基因PCR擴增結果A:隱孢子蟲18S rRNA 基因 ; B:賈第鞭毛蟲β-giardin基因 ； C:犬細小病毒VP基因

M: DL-2 000 bp DNA相對分子質量標準； P+：陽性對照；N-：陰性對照； 1-4、5、6：樣品1-4、5、6