銀連解毒口服液提取工藝研究

趙增成 ， 李桂明 ， 宋敏訓 ， 李 穎 ， 楊世發 ， 黃中利 ， 馮敏燕 ， 傅 劍 ， 林樹乾

(山東省農業科學院家禽研究所 ， 山東濟南250023)

銀連解毒口服液是我們研發的新獸藥，由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、牛蒡子、竹葉、甘草等組成。功效為辛涼解表，清熱解毒，可用于家禽溫熱疾病的防治。因處方中，薄荷、荊芥含有揮發油成分，且具有重要的生物活性，因此先采用共水蒸餾法對薄荷、荊芥進行了揮發油提取，提取后的藥渣與剩余藥味再進行煎煮水提。為了篩選出最佳的提取工藝參數，對提取工藝中的最重要影響因素加水量、浸泡時間、提取時間、提取次數進行了篩選研究。

1 材料與方法

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀、AB265-S型雙量程十萬分之一電子天平、KQ5200DB型超聲儀、揮發油測定器。

1.2 藥品與試劑 綠原酸對照品、牛蒡苷對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院。各中藥飲片，購自濟南宏濟堂藥店。乙腈為色譜純試劑，甲醇、磷酸均為分析純試劑。

1.3 揮發油提取工藝篩選 為了篩選出薄荷、荊芥中揮發油的最佳提取條件，提高揮發油提取率，采用單因素試驗對影響揮發油提取率的主要因素提取時間、加水量、浸泡時間進行考察。

1.3.1 加水量的考察 按處方比例，稱取薄荷60 g、荊芥40 g，共100 g，分別加入6倍、8倍、10倍量的水，用揮發油測定器進行蒸餾，提取5 h，記錄出油量。

1.3.2 浸泡時間的考察 稱取薄荷60 g、荊芥40 g，共100 g，加入8倍量的水，分別浸泡0.5 h、1 h、2 h，用揮發油測定器進行蒸餾，提取5 h，記錄出油量。

1.3.3 提取時間的考察 稱取薄荷60 g、荊芥40 g共100 g，用揮發油測定器進行蒸餾，分別在開始回流后的不同時間，記錄出油量。

1.4 中藥浸泡時間篩選 中藥的浸泡時間與吸水率對提取有一定的影響，但中藥的浸泡一般按完全浸透為原則。取處方量的中藥飲片1 000 g，加入6倍量的水浸泡，每間隔0.5 h，觀察1次浸潤程度，并將水過濾盡，稱量濕藥重量，計算吸水率，記錄吸水率達到飽和的時間。

吸水率=(藥材濕重-藥材干重)/藥材干重×100%

1.5 煎煮工藝篩選 在確定了藥材浸泡時間后，采用正交試驗對本品煎煮工藝進行了篩選研究，選定加水量、煎煮時間、煎煮次數3個因素，以干膏量、綠原酸含量和牛蒡苷含量為評價指標，對最佳提取工藝進行優選。

1.5.1 試驗設計 選取中藥加水量(A)、煎煮時間(B)、煎煮次數(C) 3個因素，進行3因素3水平篩選試驗，因素水平試驗設計見表1。選用正交表L9(34)進行正交試驗設計[1-2]，共進行9組試驗，正交試驗方案見表2。

1.5.2 試驗方法 按處方比例稱取相同的中藥飲片共9份，每份1 000 g，其中薄荷、荊芥取蒸餾后的藥渣，按表2試驗條件分別進行煎煮，濾過，煎煮液最后濃縮至1 g/mL。

表1 煎煮工藝因素水平表

表2 煎煮工藝正交試驗

取蒸發皿9個，105 ℃干燥至恒重，精密稱定其重量。分別精密吸取所制備的9份中藥濃縮液各10 mL至上述蒸發皿中，水浴蒸至近干，置105 ℃干燥3 h，轉移至干燥器中冷卻0.5 h，精密稱定，所得重量減去蒸發皿重量，即得干膏重量。

分別對制備的9份中藥濃縮液，按制定的銀連解毒口服液質量標準草案，以高效液相色譜法(HPLC)對綠原酸、牛蒡苷含量進行測定。

1.5.3 綠原酸含量測定 色譜條件與系統適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.4%磷酸溶液(13∶87)為流動相；檢測波長為327 nm。理論板數按綠原酸峰計算應不低于1 000。

對照品溶液的制備：取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含40 μg的溶液，即得(10 ℃以下保存)。

供試品溶液的制備：精密量取本品2 mL，置50 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲20 min，搖勻，即得。

測定法：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

1.5.4 牛蒡苷含量測定 色譜條件與系統適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.4%磷酸溶液(25∶75)為流動相，檢測波長為277 nm，理論板數按牛蒡苷峰計算應不低于1 000。

對照品溶液的制備：取牛蒡苷對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每毫升含0.6 mg 的溶液，即得(10℃以下保存)。

供試品溶液的制備：精密量取本品5 mL，置50 mL 棕色量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20 min，混勻。

測定法：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，測定，即得。

1.5.5 統計方法 以干膏量、綠原酸含量、牛蒡苷含量作為評價指標，設定三者的加權系數分別為0.4、0.3、0.3，采用綜合加權評分法，計算出各次試驗的綜合評分。具體評分方法：以干膏重量最大的1次試驗判為100分，按照每次試驗干膏量與最大干膏量的比例，計算各自干膏量指標中的得分。同法，分別計算每次試驗的綠原酸和牛蒡苷含量得分。最后按照3項指標的加權系數，計算出各次試驗的綜合評分。

根據綜合評分結果，采用極差法進行最佳因素排序，并得出最優組合。采用方差分析，得出各因素對評價指標的顯著影響程度。

2 結果與分析

2.1 揮發油提取結果

2.1.1 不同加水量揮發油提取結果 加水量對揮發油提取量具有一定的影響，加8倍量水時，揮發油提取量最多。詳見表3。

表3 不同加水量薄荷、荊芥揮發油累計提取量 (mL)

2.1.2 不同浸泡時間揮發油提取結果 中藥浸泡時間對揮發油提取量影響不明顯，本著節約時間和提高效率的原則，浸泡時間確定為0.5 h。見表4。

2.1.3 不同蒸餾時間揮發油提取結果 試驗表明，加熱蒸餾1 h內出油最快，且已基本提盡，綜合考慮能源的節約，提取時間選擇為蒸餾1 h。見表5。

表4 不同浸泡時間薄荷、荊芥中揮發油累計提取量 (mL)

表5 不同時間薄荷、荊芥中揮發油提取量

2.2 藥材浸泡時間及吸水率考察結果 不同浸泡時間藥材的吸水率情況，見表6。

表6 不同浸泡時間藥材吸水率

由表6可知，當浸泡2 h時，吸水已達到飽和狀態，此時藥材已完全浸透，吸水率為 220% ，因此確定藥材最佳浸泡時間為2 h。

2.3 煎煮工藝正交試驗結果 正交試驗的結果見表7，方差分析結果見表8。

表7 正交試驗結果

表8 正交試驗結果方差分析

極差直觀分析結果表明，影響因素大小為C>A>B，即煎煮次數>加水量>煎煮時間。優選條件為A3B3C3。

方差分析結果表明，A(加水量)、B(煎煮時間)、C因素(煎煮次數)對評價指標均具有顯著影響(P<0.05)。

綜合分析以上結論，最佳工藝參數選擇為：加水量為10倍藥量，煎煮時間為1.5 h，共煎煮3次。

3 討論

3.1 本試驗確定出了處方藥物薄荷、荊芥的揮發油最佳提取工藝，即將中藥飲片加8倍量水，浸泡0.5 h，蒸餾提取1 h，可取得最佳的提取效益。

3.2 通過浸泡試驗和正交試驗，綜合考慮干膏量、綠原酸含量、牛蒡苷含量3項評價指標，將最佳煎煮工藝確定為：加水量為10倍藥量，浸泡2 h，每次煎煮1.5 h，共煎煮3次。

3.3 薄荷、荊芥中含有大量的揮發油成分，現代研究表明，揮發油具有抗炎、抗病毒、抑菌、解熱鎮痛等作用[3-4]，是不可缺少的有效成分，發揮著重要的治療作用。但揮發油有非常強的揮發性，且水溶解性較差，不能大量溶解于水[5-6]。如果將薄荷、荊芥與其他的藥物放在一起直接煎煮，揮發油成分就可能全部損失掉，嚴重影響藥物的療效。因此，將薄荷、荊芥采用了先單獨提取揮發油的生產工藝。

3.4 本制劑中金銀花清熱解毒、辛涼透表為主藥，牛蒡子疏散風熱、解毒利咽為臣藥。金銀花的主要活性成分為綠原酸，牛蒡子的主要活性成分為牛蒡苷，它們均是重要的生物活性物質，具有抗菌、抗病毒等作用[7-8]，因此將綠原酸、牛蒡苷含量作為工藝篩選的評價指標。