無乳鏈球菌耐藥性及耐藥基因檢測

路 璐 ， 祝 宇 ， 顏興瓊 ， 龔 蕾 ， 孫衛星 ， 楊金朋 ， 曲偉杰

(云南農業大學動物醫學院 ， 云南昆明650201)

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae，GBS)，又稱B群鏈球菌，它是一種具有高度傳染性的專性乳腺寄生菌。在我國，因無乳鏈球菌引起的奶牛乳房炎發病率高達20%～40%，在德國[1]和巴西[2]等地也可達到11%～60%。可見，無乳鏈球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，應引起科研人員的高度重視。

近年來，國內外的研究均表明，抗生素在臨床上的廣泛使用導致致病菌的耐藥性問題越來越嚴重，尤其是多重耐藥現象的產生給奶牛乳房炎的臨床治療帶來了很大困難。因此，及時準確的掌握致病菌的耐藥情況是目前防治奶牛乳房炎的關鍵，這對于指導臨床合理使用抗生素、防治無乳鏈球菌性乳房炎有著極其重要的意義。本試驗對15株無乳鏈球菌臨床分離株進行藥敏試驗，并檢測其攜帶的主要耐藥基因，旨在了解本地區的無乳鏈球菌的耐藥情況，為指導臨床合理用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 采自昆明某地區的71份隱性乳房炎(經蘭州乳房炎檢測法LMT檢測體細胞數>50萬/mL)病牛乳樣。

1.2 質控菌株 金黃色葡萄球菌 ATCC25923，由云南農業大學動物科學技術學院實驗室凍存；GBS標準株，購自廣東微生物菌種保藏中心。

1.3 培養基和主要試劑 5%綿羊鮮血瓊脂培養基；革蘭染色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；鏈球菌屬生化編碼鑒定管，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒和Gold view核酸染料，購自天根生化科技(北京)有限公司；2×RapidTaqMaster Mix，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖，購自北京沃比森科技有限公司；DL-2 000 DNA Marker，購自TaKaRa(大連)公司。

1.4 主要儀器設備 所用儀器包括超凈工作臺、生化培養箱、氣浴恒溫振蕩器、微量移液器、離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析儀等。

1.5 病原菌的分離培養及鑒定

1.5.1 菌株的分離及生化鑒定 用無菌棉拭子輕輕蘸取采集的乳樣在5%綿羊鮮血瓊脂培養基上劃線，于37 ℃ 恒溫培養24 h，觀察菌落形態，并挑取疑似菌落進行純培養。于血平板上挑取疑似菌落進行涂片、革蘭染色、鏡檢，觀察其菌體形態。挑取革蘭染色陽性的疑似鏈球菌的菌落接種血平板進行純培養后進行觸酶試驗、CAMP檢測和生化鑒定。

1.5.2 分子生物學鑒定 參考GenBank公布的無乳鏈球菌菌16S rDNA和特異性cfb基因序列，用Primer 5.0設計引物，采用PCR擴增法對疑似菌株進行鑒定，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物信息見表1。PCR 陽性產物直接送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.6 藥敏試驗 采用世界衛生組織(WHO)推薦的紙片擴散法Kirby-Bauer(K-B)，測定無乳鏈球菌對抗菌藥物的敏感性。取細菌純培養菌液0.2 mL滴入LB瓊脂培養基中，用三角環均涂勻后用滅菌鑷子將藥敏紙片均勻貼于培養基表面，每個培養皿貼5片，輕壓使其與瓊脂表面完全接觸；將培養皿倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養12～24 h，用尺子測量每個藥敏紙片的抑菌直徑，記錄重復3次，抑菌圈直徑為3次重復試驗結果的平均值。參照美國臨床實驗室標準委員會(Nccls)規定的標準進行判定。

1.7 青霉素及紅霉素耐藥基因的檢測 通過藥敏試驗可知分離菌對青霉素及紅霉素高度耐藥，因此，通過GenBank和相關文獻資料[3-4]査閱無乳鏈球菌青霉素及紅霉素相關的耐藥基因序列，運用Primer 5.0設計引物，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。采用PCR法擴增β-內酰胺類耐藥基因pbp1a、pbp2b、pbp2x，大環內酯類耐藥基因ermA、ermB、mefA，PCR產物純化后送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。各耐藥基因的引物信息見表1。

表1 引物信息

2 結果與分析

2.1 無乳鏈球菌的分離與鑒定

2.1.1 細菌的形態及染色特性 在5%血平板上可見到菌落呈灰白色、半透明、表面光滑、圓形隆起的小菌落，呈β溶血；挑取疑似單菌落涂片鏡檢，結果顯示為革蘭陽性菌，呈鏈狀排列；觸酶試驗為陰性。將鏡檢形態均符合鏈球菌特性，且觸酶試驗為陰性的細菌，判定為鏈球菌屬細菌。本試驗從71份隱性乳房炎乳樣中分離到鏈球菌36株。

2.1.2 CAMP及生化試驗結果 CAMP檢測可觀察到部分血平板上金黃色葡萄球菌和分離菌劃線交界處出現箭頭樣的β溶血區，結果顯示呈陽性。

鏈球菌分離株的3次生化試驗結果比較穩定，其結果顯示，有部分分離株均能發酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、蕈糖，馬尿酸鈉陽性，七葉苷、甘露醇、山梨醇呈陰性，水解精氨酸呈陽性，V-P試驗陽性，PYR試驗陰性。與《伯杰氏細菌鑒定手冊》相對照，鑒定出無乳鏈球菌15株，所占比例為41.7%。

2.1.3 PCR鑒定結果 對臨床分離的36株疑似鏈球菌進行PCR鑒定，結果顯示，有15株分離菌通用引物PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像系統可看到在1 500 bp處出現明亮的條帶；其特異性引物則在903 bp處出現明亮的條帶，兩種引物均與預期條帶一致(圖1、2)。在NCBI網站上進行BLAST程序比對分析，結果顯示與無乳鏈球菌的同源性均在99%以上。該結果與上述生化鑒定結果一致。

圖1 15株無乳鏈球菌通用引物PCR產物電泳圖

M：DL-2 000 Marker；W：陽性對照； 1～15：PCR產物； 16：陰性對照

圖2 15株無乳鏈球菌特異性引物PCR產物電泳圖

M：DL-2 000 Marker；W：陽性對照； 1-15：PCR產物； 16：陰性對照

2.2 藥敏試驗結果 分別對15株奶牛乳房炎源無乳鏈球菌臨床分離株進行藥敏試驗，結果表現出不同程度的耐藥性。該試驗結果表明，本試驗無乳鏈球菌對目前臨床上使用的大部分抗生素比較敏感，如對頭孢類抗生素、四環素類、喹諾酮類及慶大霉素、卡那霉素、復方新諾敏中度或高度敏感，可供臨床參考；但也有部分菌株對一些藥物產生了不同程度的耐藥性，如對青霉素、紅霉素、林可霉素、克林霉素、萬古霉素、氨芐西林、新生霉素、磺胺異惡唑的耐藥率均較高，耐藥率依次分別為100%、93.3%、93.3%、93.3%、93.3%、80%、80%、53.3%，尤其是對青霉素嚴重耐藥，其耐藥率達到100%。藥敏試驗結果見表2。

15株無乳鏈球菌分離株，表現出不同的耐藥類型，其中最少的是3耐(1株)，最多可達到15耐(1株)。大部分菌株表現出7種或8種耐藥表型，其中7耐有5株，占33.3%；8耐有4株，占26.7%。在分離的15株無乳鏈球菌中，共出現10種耐藥譜。該結果表明，奶牛場長期頻繁大量使用青霉素、紅霉素等藥物，并且不按照相關用藥規定使用，濫用抗生素，導致如此高的多重耐藥現象的產生，這種現象應引起高度的重視。15株無乳鏈球菌分離株的相關耐藥譜及耐藥類型見表3。

2.3 耐藥基因檢測結果 采用PCR法對β-內酰胺類耐藥基因pbp1a、pbp2b、pbp2x，大環內酯類耐藥基因ermA、ermB、mefA進行了檢測，并將測序結果在NCBI上進行了BLAST比對，試驗結果顯示在β-內酰胺類耐藥基因檢測中，15株無乳鏈球菌均檢出pbp1a和pbp2b基因，其檢出率均達到100%，但未檢出pbp2x；在大環內酯類耐藥基因檢測中，ermB的檢出率達到100%，15株均含有ermB基因，ermA和mefA基因均未檢出。耐藥基因檢測結果見圖3、4、5。

表2 15株無乳鏈球菌分離株藥敏試驗結果

注：S：敏感，I:中介R：耐藥

表3 15株無乳鏈球菌分離株耐藥類型和耐藥譜

圖3 15株無乳鏈球菌pbp1a基因的PCR檢測結果

M:DL-2 000 Marker；P:陽性對照； 1～15：PCR產物； 16：陰性對照

圖4 15株無乳鏈球菌pbp2b基因的PCR檢測結果

圖5 15株無乳鏈球菌ermB基因的PCR檢測結果

M:DL-2 000 Marker；P:陽性對照； 1～15：PCR產物； 16：陰性對照

3 討論

無乳鏈球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，近年來，由于奶牛乳房炎的感染增多，臨床上常選擇性應用青霉素等抗生素成為奶牛養殖場常用的防治措施之一[5-7]，加之抗菌藥的不合理使用，使得細菌的耐藥性增加，常用抗菌藥物(β-內酰胺類)的殺菌作用大大減弱。本次試驗通過對分離的15株無乳鏈球菌耐藥性檢測結果可知本地區無乳鏈球菌分離株對常用的青霉素類、紅霉素、林可胺類等抗生素存在不同程度的耐藥現象，尤其對青霉素完全耐藥，故臨床上不能繼續使用此類藥物來治療乳房炎，應選擇敏感性高的藥物，如頭孢類、喹諾酮類等抗生素控制乳房炎。此外，該地區的多重耐藥現象也比較嚴重，其中以7耐和8耐居多，共9株，占60%，這很可能是本地區奶牛乳房炎的治療失敗原因之一。因此，在治療奶牛乳房炎時應合理使用抗生素，定期進行耐藥性檢測，及時調整藥物使用方案。

本試驗通過對耐青霉素和紅霉素的分離菌進行常見耐藥基因的檢測結果顯示，15株無乳鏈球菌均檢出攜帶ermB、pbp1a和pbp2b基因，說明在本地區導致無乳鏈球菌紅霉素耐藥的主要機制是ermB基因，而pbp1a和pbp2b基因是導致該菌青霉素耐藥的主要機制。本次試驗結果分析可知，耐藥性菌株攜帶erm和pbp基因，其中所有分離菌均含有pbp1a和pbp2b兩種耐藥基因，與藥敏試驗結果一致，均表現出青霉素耐藥，而大部分攜帶ermB基因的菌株與藥敏試驗結果相符，表現出紅霉素耐藥，但有1株菌攜帶ermB基因卻不對紅霉素耐藥，這很可能是由于該株菌基因不表達或其表達量較低引起的。由于青霉素和紅霉素均存在多種耐藥基因，且各地區基因的分布情況差異較大，為了完全弄清楚該地區奶牛乳房炎無乳鏈球菌耐藥基因分布情況，還需要進一步對其進行更廣泛更深入的探究。