黃芩提取物對豬鏈球菌溶血素抑制作用的試驗

張 偉 ， 孫 忻 ， 張 沛 ， 李 莉

(1. 吉林大學動物醫學學院 ， 吉林長春130062 ； 2. 天津農學院動物科學與動物醫學學院 ，天津西青300384 ； 3. 吉林大學動物科學學院 ， 吉林長春130062)

豬鏈球菌是一種世界范圍內廣泛分布的革蘭陽性人獸共患致病菌，對養豬業造成了極大的危害，可以引發人和動物包括腦膜炎、鏈球菌中毒綜合征、菌血癥在內的多種致死性疾病，嚴重危害公共衛生安全。豬鏈球菌根據莢膜抗原不同分為多個血清型，其中豬鏈球菌2型毒力最強、危害最大。我國分別于1998年和2005年先后兩次暴發了豬鏈球菌病，數百人感染，并出現多起死亡病例，造成了極大的危害和經濟損失。目前，臨床上主要采用抗生素對豬鏈球菌感染進行治療，然而傳統抗生素類藥物主要以殺滅細菌為目的，給予細菌較強的生存選擇壓力，容易引發細菌耐藥性的產生。隨著耐藥性豬鏈球菌的日益增多，使得傳統治療豬鏈球菌感染的效果逐漸降低，因而，新的抗感染策略以及藥物急需被提出。而近些年來，隨著分子生物學等學科的快速發展，致病菌的毒力因子在細菌致病過程中所發揮的關鍵作用也越來越多的引起人們的關注[8]。而豬鏈球菌攜帶和分泌的包括溶血素(Suilysin,SLY)、分選酶A、莢膜多糖等在內的多種毒力因子，這些毒力因子與其致病作用有著密切的關系，并且在致病過程中發揮著重要的作用。其中，SLY屬于膽固醇依賴家族，一種重要的外分泌毒素。已有研究證明相較于SLY低分泌菌株，SLY高分泌的豬鏈球菌菌株在感染中具有更強的毒力和侵襲性。而SLY缺失株感染小鼠后可以顯著降低感染小鼠的死亡率[11]。此外，Takeuchi等研究發現，SLY在小鼠感染豬鏈球菌腦膜炎模型中發揮著重要的作用，并且在豬鏈球菌腦膜炎患者體內分離出的菌株具有SLY高分泌量。進而提示我們SLY可能在豬鏈球菌通過血腦屏障過程中發揮一定作用。綜上，SLY可能是一個治療豬鏈球菌感染的潛在作用靶標。

本試驗選擇 SLY為作用靶點，發現黃芩提取物在不抑制豬鏈球菌生長的條件下，可顯著降低豬鏈球菌培養物上清的溶血活性，并且分別在體內和體外證明了黃芩提取物對豬鏈球菌感染具有明顯的保護作用，從而進一步充實了黃芩提取物作為治療豬鏈球菌感染的先導復合物的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗所需黃芩，購自河北金葉子藥業有限公司；所選用菌株豬鏈球菌2型ZY05719由南京農業大學范紅結教授惠贈，J774細胞由本實驗室保存，雌性C57BL/6J小鼠(6～7周齡)，購自吉林大學實驗動物中心。

1.2 黃芩提取物制備 取黃芩20 kg進行粉碎，在水中進行煎煮3次，每次2 h，并將煎液進行合并、濃縮，調節pH值至2.0。80 ℃靜置后濾過，沉淀物加水混勻后調節pH值至7.0，加入等體積乙醇進行浸提，反復3次，合并所得濾液，60 ℃條件下進行減壓濃縮得到黃芩浸膏。取所得浸膏溶解于二甲基亞砜(DMSO)制備終濃度為10 mg/mL的工作液，4 ℃保存備用。

1.3 黃芩提取物對豬鏈球菌最小抑菌濃度的測定 采用肉湯微量稀釋法(美國臨床實驗室標準化協會推薦)測定黃芩提取物對豬鏈球菌ZY05719的最小抑菌濃度。

1.4 豬鏈球菌生長曲線的測定 將豬鏈球菌ZY05719振搖培養至OD600 nm值=0.3后，進行平均分裝，并在每個等量分裝體系內分別加入不同濃度的黃芩提取物，使各體系的終濃度分別達到0、8、16、32 μg/mL和64 μg/mL，之后繼續培養，每間隔30 min分別測定各樣品在OD600 nm條件下的吸光度值，共計6 h。

1.5 豬鏈球菌培養物上清的溶血試驗 豬鏈球菌ZY05719振搖培養至對數生長后期，將細菌培養物進行離心，收集培養物上清液，分別取100 μL該培養物上清液加入到875 μL已經加入不同濃度梯度的黃芩提取物的PBS中，37 ℃恒溫條件下靜置孵育30 min，孵育結束后，各反應體系中分別加入25 μL脫纖維兔血，再次于37 ℃靜置培養30 min，完畢后離心收取上清，分別測定各上清的OD540 nm條件下的吸光度值

1.6 活死細胞染色和LDH檢測試驗 鼠巨噬樣細胞J774在含有10%胎牛血清的完全DMEM培養基中培養，用胰蛋白酶進行消化處理后，接種于96孔細胞培養板中，每孔5×104CFU繼續培養24 h。將豬鏈球菌ZY05719振搖培養至OD600 nm值=0.5，離心收集菌體，用PBS洗菌3次后，用完全的DMEM培養基稀釋并調整菌液濃度值1×108CFU/mL，之后加入不同濃度的黃芩提取物使得終濃度分別達到0、8、16、32 μg/mL和64 μg/mL，用該藥菌混合物感染細胞，在37 ℃、5%CO2條件下共培養5 h后，用LDH檢測試劑盒檢測細胞上清液乳酸脫氫酶釋放量(OD490 nm值)，用Live/Dead 試劑進行細胞染色，采用激光共聚焦顯微鏡采集圖片。

1.7 動物感染試驗 將40只雌性C57BL/6J小鼠隨機分成2兩組，每組20只，分別腹腔注射感染200 μL豬鏈球菌ZY05719(1×109CFU/mL)，其中給藥組按100 mg/kg·bw，皮下給予黃芩培養物，對照組給予DMSO。連續觀察96 h，統計死亡率。

1.8 數據統計分析 試驗數據統計以平均值±標準差表示并采用SPSS 13.0統計軟件對組間數據進行了雙尾顯著性檢驗分析，其中P<0.05被視為差異顯著，用*表示；P<0.01視為差異極顯著，用**表示。

2 結果

2.1 黃芩提取物不具有抗菌活性 本試驗通過最小抑菌濃度(MIC)和生長曲線的測定來觀測黃芩提取物對豬鏈球菌的抗菌活性。結果表明，黃芩提取物對豬鏈球菌ZY05719的MIC濃度大于1 024 μg/mL，并且通過生長曲線的繪制發現，試驗所選黃芩提取物的濃度幾乎不影響豬鏈球菌ZY05719的生長(圖1)，綜上研究發現，黃芩提取物無抗菌活性。

圖1 在不同黃芩提取物濃度的作用下豬鏈球菌的生長曲線

2.2 黃芩提取物可以抑制豬鏈球菌培養物上清溶血活性 SLY屬于膽固醇依賴家族，具有紅細胞裂解活性，通過這一表型特征，我們通過溶血試驗研究發現，黃芩提取物可以顯著抑制豬鏈球菌培養物上清的溶血活性，相比較于未加入黃芩提取物的對照組，黃芩提取物為32 μg/mL、 64 μg/mL的豬鏈球菌培養物上清的溶血活性均發生極顯著的下降(圖2)，并且這種溶血活性的抑制作用呈現明顯的濃度依賴性。

圖2 黃芩提取物對豬鏈球菌菌液上清溶血作用的抑制作用

2.3 黃芩提取物可以降低豬鏈球菌感染所造成的宿主細胞死亡 在體外研究黃芩提取物在豬鏈球菌感染過程中的保護作用，我們通過活死細胞染色試驗和LDH檢測分別進行了定性和定量分析。在活死細胞染色試驗中，損傷的死細胞被染料染成紅色，而活細胞被染成綠色，如中插彩版圖3a所示，細胞與豬鏈球菌共培養后，感染細胞發生了明顯的死亡，大面積呈現紅色染色。而加入黃芩提取物治療組感染細胞的死亡明顯減少，細胞狀態也有所好轉，如中插彩版圖3b所示，黃芩提取物明顯降低了感染細胞的死亡。此外，黃芩提取物本身對細胞無毒性(中插彩版圖3c)。并且，我們進一步通過檢測細胞上清液內LDH的釋放量，定量說明了黃芩提取物可以有效地緩解豬鏈球菌感染所造成的細胞損傷(中插彩版圖3d)，當黃芩培養物濃達到64 μg/mL時，相較于對照組，感染細胞的死亡率由39.87%下降至7.89%。

2.4 黃芩提取物可以延緩感染豬鏈球菌小鼠的死亡 我們通過對感染豬鏈球菌的小鼠給予黃芩提取進行治療，小鼠感染豬鏈球菌后精神沉郁，被毛凌亂，發生了明顯的死亡，感染96 h后，感染小鼠除1只外其余全部死亡。而給予黃芩提取物進行治療的小鼠，精神狀態有所改善，雖然感染后也發生死亡，但相比對照組明顯被延緩，感染96 h后，仍有5只存活(圖4)。

圖4 黃芩提取物對豬鏈球菌感染小鼠存活率的影響

3 討論

豬鏈球菌感染一直以來都是公共衛生安全和養豬的一個巨大威脅，對豬鏈球菌感染的有效治療也是一個困擾著人們的難題。目前，臨床上主要采用抗生素來治療豬鏈球菌感染。抗生素在人類和病原菌斗爭的過程中做出過不可磨滅的貢獻，一度成為人類治療細菌性疾病和養殖業的健康的發展的重要依仗，然而抗生素多是以殺滅細菌為主要目的，給予細菌極大的生存選擇壓力，因而極易誘發細菌產生耐藥性。當下細菌耐藥性的問題日益嚴重，而新型抗生素的研發速度遠遠低于細菌耐藥性的產生的速度，新型抗感染策略和機制藥物迫切需要被提出[13]。同樣，臨床上已經分離出多種針對各種抗生素產生耐藥性的豬鏈球菌菌株，豬鏈球菌的耐藥性問題日益嚴峻[14]。毒力因子在細菌致病過程中發揮重要作用，與傳統抗生素作用機制不同，抗毒力策略選擇作用毒力因子不會給細菌造成生存壓力，因而可以減緩細菌耐藥性的產生，近年來相關方面的研究也越來越多的得到人們的認可。而豬鏈球菌所產生的毒力因子SLY在感染過程發揮著重要的作用，敲除后其毒力顯著降低[11]，因而選擇抑制SLY可能會治療豬鏈球菌感染中發揮重要作用。

本試驗發現，在不影響豬鏈球菌正常生長的條件下，黃芩提取物可以顯著抑制豬鏈球菌上清的溶血活性，因而提示該提取物不會給細菌較大生存選擇壓力，并可以有效降低其分泌的溶血素的生物活性作用，是一種符合抗毒力策略的潛在治療豬鏈球菌感染的先導復合物。我們通過在體外和體內研究黃芩提取物對豬鏈球菌感染的作用，進一步證明了黃芩提取在體外可以有效地保護豬鏈球菌感染細胞的死亡，明顯的抑制了SLY多介導的細胞毒性。并且，體內研究也發現黃芩提取物可以延緩感染小鼠的死亡，并降低感染小鼠的死亡率。綜上表明，黃芩提取物是一種通過靶向SLY而在豬鏈球菌感染中發揮治療作用的先導復合物。