倒扣草水煮液和抗菌藥聯用對3株多重耐藥大腸桿菌的體外抑菌效果研究

王莉貞 ， 黃雅鑫 ， 黃采算 ， 李 錚 ， 李 崇 ， 賴重波 ， 梁祺英 ， 張 羽 ， 司紅彬

(1.廣西大學動物科學技術學院 ， 廣西南寧530005 ； 2.百色市右江區水產畜牧獸醫局 ， 廣西百色533000)

倒扣草(Achyranthes aspera L.)為莧科植物粗毛牛膝的全草。主要分布廣東、廣西、云南、貴州、福建、湖南、山東、江蘇等地。倒扣草的種子、根、莖和葉中均有一定的藥用價值。倒扣草的藥用價值主要體現在利小便，清血，消毒。治紅白痢疾，喉疾，跌打損傷，壯筋骨，散血，止痛，理腳氣[1]。

倒扣草的種子、根、莖和葉中含有很豐富的脫皮甾酮，其中以種子中含量最高。全草含倒扣草堿 (ahyranthine) 、β-蛻皮甾酮 (β-ecdysterone) 、甜菜堿 (betaine) , 種子中主要為倒扣草皂苷A、倒扣草皂苷B，根含皂苷, 其苷元均為齊墩果酸[2]。脫皮甾酮具有促進成骨細胞增殖[3], 促進傷口愈合[4], 降血脂, 降膽固醇, 抑制血糖上升的生物活性[5]。晉軍等研究發現，蛻皮甾酮可以刺激內皮細胞VEGF表達上調抑制內皮細胞凋亡，從而具有內皮細胞保護作用[6]。 齊墩果酸具有抗糖尿病、抗炎、抗腫瘤等作用[7]；齊墩果酸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、結核分枝桿菌、綠膿桿菌、志賀菌、鏈球菌均有一定的抑菌效果[8]。

大腸桿菌是臨床獸醫上常見的條件致病菌。近年來，多重耐藥大腸桿菌嚴重威脅到畜牧業的發展，同時耐超廣譜β-內酰胺類、氨基糖苷類、磺胺類、氟喹諾酮類等多種抗生素的超級細菌頻繁報道。中藥與抗生素相比具有使細菌不易產生耐藥性、對動物機體的副作用小、價格低廉等優點。因此，研發中藥制劑作為防控多重耐藥細菌性疾病成為現在的研究熱點。

倒扣草可以治療小兒黃疸[9]、腰肌勞損[10]、與白花丹、蓖麻葉聯用母牛胎衣不下[11]。倒扣草水煮液用于抗菌試驗較少報道，本試驗擬用倒扣草水煮液與16種常用抗菌藥聯用，對3株含有多重耐藥基因的大腸桿菌做藥敏試驗及聯合棋盤試驗研究，對臨床獸醫預防多重耐藥大腸桿菌病起到指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料 倒扣草全草，購自廣西太華藥業有限公司。抗菌藥頭孢噻呋鈉(Ceftiofur Sodium)、阿米卡星(Amikacin)、阿莫西林(Amoxicillin)、磷霉素(Fosfomycin)、阿奇霉素(Zithromax)、利福平(Rifampin)、磺胺間甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine)等16種抗菌藥物用蒸餾水稀釋至終濃度為6 400 μg/mL，氟苯尼考為5 120 μg/mL。營養肉湯、營養瓊脂、麥康凱瓊脂和伊紅美藍瓊脂等，購自北京奧博星生物技術有限責任公司。3株多重耐藥大腸桿菌由廣西大學中獸醫實驗室分離。

1.2 菌株的分離與鑒定 從病死雞中分離培養大腸桿菌菌株，在普通營養瓊脂培養基、麥康凱培養基和伊紅美藍培養基劃線培養，并在光學顯微鏡下觀察。選擇疑似大腸桿菌菌株進行16S RNA的PCR擴增，并送生工(上海)生物科技有限公司進行測序。參照GenBank已發表的CTX-M 基因序列，設計引物如下：16S RNA-F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'；16S RNA-R：5'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3'，預期片段為908 bp。

1.3 倒扣草水煮液的制備 取倒扣草全草100 g，按照料液比1∶10加入蒸餾水、浸泡過夜。第二天小火煮沸1 h,再按照1∶8、1∶6的比例加入蒸餾水，小火煮沸1 h，將3次的濾液收集合并，減壓抽濾2次，濃縮濾液至100 mL，此時倒扣草水煮液的濃度約為1 g/mL。

1.4 倒扣草與抗菌藥對產CTX-M 型超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌的最小抑菌濃度(MICs)的測定 采用微量肉湯二倍稀釋法測定倒扣草水煮液與16種抗菌藥對多重耐藥大腸桿菌的最小抑菌濃度(MICs)，操作過程按照CISI標準(2010版)。

1.5 倒扣草水煮液與抗菌藥對產CTX-M 型超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌聯合的抑菌試驗 按照96孔板縱、橫2個方向分別對倒扣草水煮液和抗菌藥進行倍比稀釋。藥物相互作用效應通過計算其最小部分抑菌濃度指數(Fractional inhibitory concentration indices，FICI)來判斷。 FICI判斷標準：當FICI≤0.5，為協同效應；當0.5

2 結果與分析

2.1 形態學觀察 在普通瓊脂培養基上，大腸桿菌呈白色菌落；在麥康凱培養基上，呈有光澤的玫紅色菌落；在伊紅美藍培養基上，呈現為有綠色金屬光澤的紫黑色菌落，在光學顯微鏡下呈短桿狀、粉紅色的革蘭陰性菌(見中插彩版圖1、2、3)。

2.2 大腸桿菌的耐藥基因型 在NCBI上使用BLAST對測序結果進行分析比對，結果顯示，所擴增的片段與NCBI中大腸桿菌的16S RNA序列同源性達到90%以上，表明該菌株為大腸桿菌。

根據對大腸桿菌E1、E2、E3的藥敏值、結合聯合棋盤FICI值分析，選取耐藥基因超廣譜β-內酰胺類耐藥基因CTX-MU、氟苯尼考耐藥基因floR、磷霉素耐藥基因fosA3三種耐藥基因進行PCR擴增。擴增條件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，退火溫度 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環， 72 ℃ 10 min；15 ℃ 60 min。在1%瓊脂糖凝膠上電泳。4種耐藥基因的引物序列見表1。結果顯示大腸桿菌E1含有CTX-MU；大腸桿菌E2含有CTX-MU，floR；大腸桿菌E3含有CTX-MU基因(如圖4)。

表1 耐藥基因引物信息

圖4 大腸桿菌E1、E2、E3的PCR擴增結果

M：Marker 2 000；泳道1、4、7：CTX-M； 泳道2、5、8：fosA3； 3、6、9：泳道floR； 10、11、12分別為基因型CTX-M、fosA3、floR的陰性對照

2.3 三株大腸桿菌對抗菌藥及倒扣草水煮液的MICs及聯合抑菌指數(FICI) 見表2。

根據倒扣草水煮液聯合16種抗菌藥對大腸桿菌的MICs及聯合抑菌指數分析，可以得知：對于大腸桿菌E1，當FICI≤0.5時，倒扣草水煮液與任何西藥聯用時，均不表現為協同效應；當0.52時，倒扣草水煮液與左旋氧氟沙星、痢菌凈、林可霉素及氟苯尼考、阿奇霉素聯用時，表現為頡頏效應。

對于大腸桿菌E2, 當FICI≤0.5時，倒扣草水煮液與氟苯尼考聯用時，表現為協同效應；當0.52時，倒扣草水煮液與頭孢噻呋鈉、環丙沙星及阿奇霉素聯用時，表現為頡頏效應。

對于大腸桿菌E3, 當FICI≤0.5時，倒扣草水煮液與磷霉素、利福平聯用時，表現為協同效應；當0.52時，倒扣草水煮液與環丙沙星、左旋氧氟沙星、阿米卡星聯用時，表現為頡頏效應。

表2 倒扣草水煮液聯合16種抗菌藥對大腸桿菌E1、E2、E3的MICs及聯合抑菌指數 (μg/mL)

黏桿菌素對大腸桿菌E1、E2，頭孢噻肟對大腸桿菌E3具有良好的敏感性，其最小抑菌濃度(MICs)均小于1.563。根據CLSI標準(2009版)，這3種抗菌藥的最小抑菌濃度(MICs)小于該抗菌藥對大腸桿菌的breakpionts。

3 討論

倒扣草對3株多重耐藥大腸桿菌菌株均有一定的抑菌效果。根據倒扣草水煮液聯合16種抗菌藥對大腸桿菌E1、E2、E3的MICs及聯合抑菌指數FICI的結果判定，以及3株大腸桿菌的耐藥基因型，發現當倒扣草水煮液與β-內酰胺類抗菌藥聯用時對3株含CTX-MU耐藥基因的大腸桿菌基本表現為無關或拮抗效應；倒扣草水煮液與利福平聯用時對3株大腸桿菌表現為協同或相加作用；與氟苯尼考聯用時對含有floR基因型的大腸桿菌E2呈現協同效應、對不含floR基因型的大腸桿菌E1和E3呈現拮抗或相加效應；倒扣草水提液與磷霉素聯用時，對大腸桿菌E3呈現協同作用；與磺胺間甲氧嘧啶鈉、阿米卡星等聯用時對3株大腸桿菌均呈現無關效應。

氯霉素抗性基因floR導致大腸桿菌對氯霉素產生抗藥性，主要是對氟苯尼考的抗藥性[12]。，當倒扣草水煮液與氟苯尼考聯用時對含有floR基因型的大腸桿菌E3呈現協同效應。 Huang D等認為齊墩果酸抗革蘭陰性菌的作用機理為它破壞了細菌的細胞外膜，引起形態改變導致細菌自溶，而吳蓓蓓等證實[13]floR基因編碼的蛋白位于細胞膜上。因此，認為倒扣草中的齊墩果酸可能破壞革蘭陰性菌細胞膜上floR蛋白，從而與氟苯尼考聯用起到協同作用，對于不含floR蛋白的大腸桿菌，齊墩果酸沒有有效的作用靶點，細菌細胞膜不發生自溶，倒扣草水煮液與氟苯尼考聯用則起到拮抗作用。

FosA是一種Mn2+和K+依賴的谷胱甘肽(GSH)轉移酶，主要在細菌細胞質內可破壞磷霉素的環氧基團并催化谷胱甘肽(GSH)與磷霉素的1位碳原子形成化合物,引起磷霉素耐藥[15]。CTX-M型耐藥基因主要是由質粒介導傳播的，在細菌的胞質內水解β-內酰胺類抗生素的β-內酰胺環，從而起到耐藥作用[15]。fosA3和CTX-M基因編碼的蛋白均不在細菌的細胞膜上，齊墩果酸在細胞膜上找不到有效的作用靶點，故磷霉素、β-內酰胺類抗生素與倒扣草水煮液聯用時基本為拮抗作用。

倒扣草水煮液與部分抗菌藥聯用可降低部分抗菌藥對多重耐藥大腸桿菌的最小抑菌濃度，從而減少或降低抗菌藥的使用量，延緩耐藥菌的產生。