禽腺病毒4型hexon基因克隆與原核表達分析

王許航 ， 王 林 ， 經 美 ， 陳 萍 ， 王金鳳 ， 孫繼國,4 ， 劉聚祥,4 ， 王建昌 ， 袁萬哲,4

(1.河北農業大學動物醫學院 ， 河北保定071001 ； 2.北京市動物疫病預防控制中心 ， 北京大興102600 ； 3.河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心 ， 河北石家莊050051 ；4.河北省獸醫生物技術工程技術研究中心 ， 河北保定071001)

2015年6月以來，我國山東、安徽、河北、河南、遼寧等省份肉雞群中發生了以心包積液、肝臟腫大為特征的疾病，根據病變，又將該病稱為雞心包積液-肝炎綜合征。該病多發生于20～30日齡左右的肉雞，發病后4～8 d為死亡高峰期，病程為8～15 d，死亡率達20%～30%。同時20～70日齡以及200～300日齡的蛋雞也有發生，但是死亡率低于肉雞。日前已經確定該病病原為Ⅰ群禽腺病毒4型(Fowl adenovirus 4, FAdV- 4)，且為高致病性毒株，可致死雛雞[1-2]。目前，該病仍然發生與流行，給我國養雞業造成了巨大的經濟損失。

FAdV- 4基因組大小約為45 kb。病毒編碼的主要結構蛋白有六鄰體(Hexon)、五鄰體、纖突等。其中Hexon蛋白帶有屬和亞屬特異性抗原決定簇，可以刺激機體產生抗體。基于此，本研究對禽腺病毒4型SDSX1株的Hexon基因進行克隆并對其原核表達條件進行優化，獲得了重組菌pQE1-hexon以及高純度的Hexon蛋白，為進一步研究FAdV-4檢測方法和新型疫苗奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 禽腺病毒4型SDSX1株由本實驗室分離并保存；2×TransTaq?HiFi PCR Super Mix I、ExnaseTMⅡ 和5×CE Ⅱ Buffer，購自武漢品生科技有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit，購自北京全式金生物技術有限公司；Rosetta2(DE3) pLySs、Top10感受態和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司;6×His,His-Tag Monoclonal Antibody，購自Proteintech公司；Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒，購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 引物設計 根據GenBank上登錄的SDSX1株基因序列(GenBank：KU845700)，應用Primer5.0軟件設計1對特異性引物，在引物序列中引入5′ linker和3′ linker，便于后續與表達載體的重組反應。引物序列如下:上游引物P1：5′-GGGTCCAGCGGCGCTGGATCCATGGCGGCCCTCACGCCCGA-3′;下游引物P2：5′-CGCTCCACTGCCTCCTGCAGCTTACACGGCGTTGCCTGTGG-3′。預期擴增的片段大小約為2 856 bp，引物由生工生物工程(上海)技術服務有限公司合成。

1.3 病毒Hexon基因的擴增 利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取雞胚分離毒SDSX1株的DNA，以此DNA為模板進行Hexon基因擴增。PCR擴增體系為：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，PrimerSTAR Max(2x)25 μL，模板1 μL，加ddH2O補充至50 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性1 min；98 ℃ 10 s，64 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min 20 s，共35個循環；72 ℃延伸2 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化目的基因。

1.4 表達載體pQE1的擴增 PCR擴增體系為：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×TransTaq?HiFi PCR Super Mix I 25 μL，模板1 μL，加ddH2O補充至50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共35個循環；72 ℃延伸5 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化目的基因。用Nanodrop分別測定目的基因Hexon和表達載體pQE1的濃度。

1.5 重組質粒的構建 將Hexon目的基因與pQE1載體按一定比例進行重組，重組反應體系：ExnaseTMⅡ 1 μL，5xCEⅡBuffer 2 μL，Hexon目的基因3 μL，表達載體pQE1 4 μL。37 ℃反應30 min，冰上放置5 min，將10 μL重組產物轉到Top10菌株，冰浴30 min，42 ℃ 90 s，冰上放置2～3 min，加入900 μL SOC培養基，37 ℃振搖1 h，離心后剩100 μL菌液涂含Kan+抗生素的LB板。菌液PCR鑒定，將陽性菌液送至測序，測序正確的質粒被命名為pQE1-Hexon。

1.6 重組質粒pQE1-hexon的原核表達 將陽性重組質粒pQE1-Hexon轉化至Rosetta2(DE3)plysS感受態細胞中，將重組菌于37 ℃培養至OD600nm值約為0.6，加入IPTG，使其終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L，誘導表達5 h，確定最適的IPTG誘導濃度；在最適IPTG誘導濃度下，分別誘導表達0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，確定最佳的誘導時間；在最適IPTG濃度和最佳誘導時間下，分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃誘導，確定最佳誘導溫度。菌液經超聲波破碎后，收集上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測。

1.7 Hexon蛋白的純化 用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒純化蛋白, 用Nanodrop測定Hexon蛋白的濃度和純度。

2 結果

2.1 目的基因PCR擴增 經PCR擴增的Hexon基因在大約2 800 bp處出現明顯的目的條帶，與預期的大小(2 856 bp)相符(圖1)。表達載體pQE1在大約5 400 bp處有明顯條帶，與預期的大小(5 407 bp)相符(圖2)。

圖1 Hexon 基因的PCR擴增

M：DNA分子標準 ； 1：Hexon基因

圖2 表達載體pQE1的PCR擴增

M：DNA分子標準 ； 1：pQE1基因

2.2 重組質粒pQE1-Hexon的菌液PCR鑒定 重組質粒pQE1-Hexon轉入Top10菌株后，經菌液PCR鑒定，在大約2 800 bp處有明顯條帶，大小與預期的2 856 bp完全相符(圖3)。

圖3 重組質粒pQE1-Hexon 的菌液PCR鑒定

M：DNA分子標準； 1-6：pQE1-Hexon基因

2.3 表達產物的SDS-PAGE分析 SDS-PAGE分析表明，Hexon基因可得到表達，蛋白分子質量約為107 kD。Hexon蛋白在25 ℃、0.8 mmol/L IPTG條件下誘導4 h獲得最大表達量，而未誘導的菌樣未出現條帶(圖4～6)。可溶性分析表明，重組蛋白以不溶性的包涵體形式存在于菌體中(圖7)。

圖4 不同時間pQE1-Hexon誘導表達SDS-PAGE檢測

M：蛋白分子標準；1：為pQE1-Hexon重組質粒未誘導表達時； 2-8：分別為pQE1-Hexon重組質粒誘導1、2、3、4、5、6、7 h后表達情況

圖5 不同IPTG濃度pQE1-Hexon誘導表達SDS-PAGE檢測

M：蛋白分子標準； 1-8：IPTG濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L時Hexon的表達情況

圖6 不同溫度 pQE1-Hexon誘導表達及可溶性SDS-PAGE檢測

M：蛋白分子標準； 1～4：分別為20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃時pQE1-Hexon誘導表達情況； 5：誘導表達 4 h時的沉淀； 6：誘導表達4 h時的上清2.4 重組Hexon蛋白的純化復性 經Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒純化蛋白，純化的蛋白經含GSH-GSSG的PBS復性緩沖液透析復性，復性條帶大小與預期目的條帶相符(圖7)，用Nanodrop測定復性蛋白的濃度為5.165 mg/mL，純度為97%。

圖7 蛋白復性的結果

M：蛋白分子標準；1：純化蛋白

3 討論

Ⅰ群禽腺病毒是一種無囊膜的雙鏈DNA病毒，呈球形，衣殼為20面體結構，直徑約70～90 nm。病毒粒子主要由240個六鄰體和12個五鄰體基底(頂點殼粒)組成。每個五鄰體有一條或兩條纖突[3]，這些纖維以五鄰體蛋白為基底由衣殼伸出[4]，在頂端形成頭節區。五鄰體和纖突的頭節區可與細胞表面的病毒受體結合[5]，在病毒感染細胞過程中起著非常重要的作用。病毒粒子含有約14條多肽，主要有3個結構蛋白，分別為：六鄰體蛋白、五鄰體蛋白和纖突蛋白。禽腺病毒4型屬于Ⅰ群禽腺病毒C種成員，其代表株ON1株通過肌肉注射感染SPF雞，不能引起臨床表現與病理損傷，為非致病性毒株[6]，而本項目組本次所分離的毒株卻能引發SPF雞死亡與病理損傷[1]，為高致病性禽腺病毒4型。目前尚無表達高致病性禽腺病毒4型Hexon蛋白的報道。

六鄰體蛋白由3個相同的單體組成，其中部和C 端較保守，它是主要的結構蛋白，含有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的型特異性抗原決定簇。六鄰體的前段和中段主要是由Loop1、Loop2及P1區組成，其比較大的抗原表位區都位于前段和中段，據此推測其具有型和群特異性表位，能誘導產生特異性抗體[7-8]。六鄰體后端主要由Loop4、P2區組成，盡管該區域有較好抗原性，但疏水性氨基酸殘基較多且暴露性差，說明該區域的總體抗原性較弱。因此，六鄰體的前段和中段可作為蛋白表達首選區。本研究采用qRex重組酶體系方法，將高致病性禽腺病毒4型Hexon全長基因克隆至原核表達載體pEQ1中，獲得了一種可高效表達蛋白的重組菌pQE1-Hexon以及高純度的Hexon蛋白，為進一步研究FAdV-4檢測方法和新型疫苗奠定了基礎。