IL-10對HepG2細胞凋亡的影響

葉 園 ， 童章隆 ， 張 寧 ， 殷偉麗 ， 王 琳 ， 李 妍

(1.吉林醫藥學院臨床醫學院 ， 吉林吉林132013 ； 2.吉林醫藥學院基礎醫學院 ， 吉林吉林132013)

原發性肝細胞癌(Primary Hepatic Carcinoma, PHC)是我國常見的惡性腫瘤之一。全世界每年約有78萬新發病例，約74萬死亡病例,其中我國約占45%,在癌癥相關死亡率中僅次于肺癌，排名第二。且肝癌的發病率逐年增加，復發率高，預后不良[1]。目前，原發性肝癌最有效的治療手段是手術，但因腫瘤大小、部位、患者肝功能情況及已發生轉移等多種原因，往往無法進行手術治療，只能選擇介入治療、放療、化療或綜合治療，但上述方法往往治療效果欠佳，預后差，大多數國家原發性肝癌5年生存率僅為3%～5%[2-3]。 因此，找尋更為有效的肝癌治療藥物或方法，提高肝癌患者的生存率，一直是肝癌治療研究的重要方向。研究表明，約有70%～90% 的原發性肝癌為肝細胞性肝癌[4]，人肝癌細胞HepG2 的組織來源為成肝細胞瘤，因此HepG2為國內外進行肝癌活性研究的經典細胞模型。

IL-10是一種多細胞源、多效性的細胞免疫抑制因子。本課題組前期研究已證實IL-10對HepG2細胞具有促進增殖的作用，本試驗在前期實驗的基礎上進一步探討IL-10對HepG2細胞凋亡水平的影響，以期進一步深入研究其促進HepG2細胞生長增殖的具體分子機制及找尋治療原發性肝癌新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞系 人肝癌HepG2細胞由吉林醫藥學院基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室朱文赫老師惠贈。

1.2 主要試劑 IL-10，購自美國PeproTech公司；DMEM高糖培養基，由美國Hyclone公司生產；胎牛血清，購自世紀元亨動物防疫技術有限公司；姬姆薩染液，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.3 主要儀器 細胞培養箱，購自北京東方安若生化科技有限公司； 超凈臺，由蘇州凈化儀器廠生產；倒置顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司產品；MuseTM細胞分析儀，購自德國默克—密理博生物科技有限公司。

1.4 細胞培養 取出于-80 ℃凍存的HepG2細胞，迅速放入37 ℃的水浴鍋中使其融化。細胞融化后移至超凈臺，將細胞懸液離心，加入含10%胎牛血清并含100 IU/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養基，吸管吹打混勻后，移入培養瓶中，置入體積分數為5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養，次日更換培養液后繼續培養。細胞為貼壁生長，待細胞覆蓋培養瓶底部80%后即可進行傳代，試驗取用對數生長期細胞。

1.5 MuseTM細胞分析儀檢測HepG2細胞凋亡變化 取對數期HepG2細胞，接種于6孔板，放入培養箱中，37 ℃進行常規培養。24 h后添加含不同濃度IL-10的細胞培養液，繼續培養24 h， IL-10的濃度分別為0(對照組)、10、20 ng/mL和 30 ng/mL。0.25%的胰酶消化，用完全培養液將每組細胞重懸成單細胞懸液，分別在1.5 mL離心管中每管加入100 μL細胞及100 μL MuseTMAnnexin V 試劑，輕輕混勻，室溫避光孵育20 min。后用MuseTM細胞分析儀檢測。

1.6 Hoechest33258染色檢測HepG2細胞凋亡水平 將培養的對數期HepG2細胞胰酶消化后，制備成細胞混懸液，常規接種于24孔板。培養24 h后，添加含不同濃度IL-10的細胞培養液，繼續培養24 h。吸出培養液，PBS洗兩遍，給予4%多聚甲醛固定10 min后再用PBS沖洗兩遍。各組加入Hoechest33258染液避光染色5 min，再次PBS沖洗，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，并計算每50個細胞中凋亡細胞數，每種濃度計數4組，每組至少重復計數3次以上。

1.7 姬姆薩染色觀察HepG2細胞形態變化 各組HepG2細胞常規接種于24孔板，加藥培養24 h后，棄上清，PBS 洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS再洗2 次，按照試劑盒說明書進行姬姆薩染色，倒置顯微鏡下觀察細胞形態學變化。計算每50個細胞中陽性細胞數，每種濃度計數4組，每組至少重復計數3次以上。

2 結果

2.1 MuseTM細胞分析儀檢測HepG2細胞凋亡率 如圖1所示，與對照組相比， 10，20 ng/mL和30 ng/mL IL-10處理細胞24 h后，均可引起HepG2早期凋亡細胞數和晚期凋亡細胞數減少，細胞存活率增加，且20 ng/mL和30 ng/ml IL-10作用更為明顯。IL-10抑制細胞凋亡的作用具有劑量相關性，隨著藥物濃度的增加，細胞總凋亡數逐漸減少。

圖1MuseTM細胞分析儀檢測IL-10對HepG2細胞凋亡的影響

2.2 Hoechest 33258染色結果 Hoechst 33258是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料。如中插彩版圖2及圖3所示，與對照組相比，IL-10組HepG2細胞Hoechst 33258染色陽性細胞數均減少，染色質凝集(亮藍色熒光) 、碎片化和邊緣化等典型凋亡細胞形態隨藥物濃度增加而緩解，與MuseTM細胞分析儀檢測不同濃度給藥組HepG2 細胞凋亡的結果相一致。

圖3 不同濃度IL-10對HepG2細胞凋亡數目的影響

注：與對照組(0劑量組)比較 ； *：P<0.05

2.3 姬姆薩染色觀察HepG2細胞形態變化 正常細胞的細胞核可被姬姆薩染液染為淡紫色均一狀，而凋亡細胞呈現染色質固縮，呈紫藍色深染。如中插彩版圖4所示，在倒置顯微鏡下可見，正常細胞呈不規則狀，胞質均勻。與對照組相比，隨著IL-10濃度的升高，細胞數目明顯增加，細胞間隙變小，凋亡細胞數目明顯降低。

圖5 不同濃度IL-10對HepG2細胞凋亡數目的影響

注：與對照組(0劑量組)比較 ； *：P<0.05

3 討論

細胞因子是指來自腫瘤微環境中免疫細胞及腫瘤細胞的低分子量可溶性蛋白質，可通過多種方式參與腫瘤的演進及轉歸過程，發揮著協同或者拮抗效應[5]。IL-10作為一種多效性的生物因子，不僅具有免疫抑制作用，還具有免疫刺激的作用，但其主要的生物學活性為免疫抑制作用。IL-10可通過多種方式發揮免疫抑制功能，如通過抑制Th1細胞增殖及IFN-γ等細胞因子的合成，促進腫瘤細胞增殖，在機體抗炎及腫瘤免疫逃逸中起重要作用，促使腫瘤發生發展[6]。

有研究表明，在抗HBX抗體陽性的慢性乙型肝炎(Hepatitis B Virus，HBV)、肝硬化及原發性肝癌患者外周血中IL-10水平明顯升高，其中重度慢性乙型肝炎患者血清中IL-10水平與慢性乙型肝炎病毒攜帶者和健康人相比均顯著升高[7-9]，提示IL-10 與肝癌的發展存在一定的關系，但具體機制尚不明確。且IL-10在多種腫瘤組織中均呈現高表達。馬旭[10]等研究證實，通過下調IL-10的水平可達到抗小鼠宮頸癌細胞增殖的作用。梁華剛[11-12]等研究發現，在肺癌患者的外周血中，IL-10的水平隨腫瘤惡性程度及轉移程度的增高而升高，在肺癌晚期患者的外周血中可檢測到CD4+、CD5+與IL-10呈負相關，與IL-10的免疫抑制作用相一致。我們通過前期試驗結果證實，一定濃度的IL-10能夠明顯促進肝癌HepG2細胞的增殖，且存在劑量依賴關系，但其機制尚不明確。

正常情況下，細胞增殖和細胞凋亡處于一種平衡狀態。研究表明，腫瘤的發生不僅與細胞增殖有關，而且與細胞的抗凋亡作用也密切相關。肝細胞癌的發生是一個多基因參與、多步驟和多階段的復雜過程，其主要表現為細胞增殖和細胞凋亡調節的失衡[13]。細胞凋亡是細胞在基因調控下的自殺現象，在惡性腫瘤的發生發展過程中具有重要的生物學意義，目前多種藥物主要通過誘導腫瘤細胞的凋亡進而抑制腫瘤生長增殖。為了進一步確定IL-10是否對肝癌HepG2細胞凋亡和增殖具有雙重調節作用，我們在前期試驗的基礎上，進一步探尋了IL-10對HepG2細胞凋亡水平的影響。

通過流式細胞術檢測顯示，IL-10可抑制細胞凋亡，且隨著藥物濃度增大，細胞凋亡率降低，活細胞數增加；Hoechest33258和姬姆薩染色均觀察到，與對照組相比，加藥組凋亡細胞數減少，細胞總數增多，細胞狀態更好。提示IL-10促進HepG2細胞增殖的機制可能是通過抑制細胞的凋亡來實現的。接下來課題組將進一步研究IL-10抑制細胞凋亡的具體分子機制，以期為尋找肝癌的特異治療靶點提供理論基礎。