Dnmt1和GnRH在母羊初情期啟動過程中下丘腦的分布定位

宮永勝 ， 丁 赫 ， 呂文發 ， 王 軍

(吉林農業大學動物科學技術學院 ， 吉林長春130118)

初情期是動物獲得繁殖能力的標志，其啟動時間關系到動物的性成熟和繁殖性能，初情期啟動過程極其復雜，其機制尚未完全闡明。現已明確，下丘腦促性腺激素細胞以脈沖式分泌GnRH，其作用于垂體上促腺激素釋放激素受體(GnRH-R)，誘發促黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)峰值引起母畜的初情期啟動[1-2]。研究表明，初情期啟動伴隨著轉錄抑制因子的DNA甲基化與組蛋白修飾的變化，從而激活相關基因參與初情期啟動[3-4]。Dnmt1作為DNA甲基轉移酶維持著基因的甲基化，在DNA復制過程中，Dnmt1按照親本DNA的鏈來修復子鏈的特異甲基化模式[5]，調控相關基因的表達。

GnRH神經元胞體主要存在下丘腦中的視前區和弓狀核[4]，DNA甲基化參與初情期啟動，初情期啟動過程中下丘腦 Dnmt1與GnRH的關系尚不清楚。本試驗通過免疫熒光雙標記技術研究Dnmt1和GnRH在母羊下丘腦中POA和ARC核團的分布及兩者的關系，研究結果不僅可明確母羊初情期啟動過程中Dnmt1和GnRH的分布規律，而且也為DNA甲基化調控母羊初情機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品 采集初情期啟動不同階段(初情期前，臨近初情期，初情期)母羊的下丘腦組織，下丘腦前端止于視交叉，后端止于乳頭體，置于4%多聚甲醛中固定48 h，轉入20%蔗糖PBS進行脫水，待其組織完全沉浸于溶液中，用OCT包埋劑對組織進行包埋，制作下丘腦組織冰凍切片，切片厚度25 μm，用于免疫熒光雙標記試驗。

1.2 藥品和試劑 OCT包埋劑、冰凍切片快速抗原修復液、免疫染色封閉液和含抗熒光淬滅封片液等試劑，購自碧云天生物技術有限公司；GnRH(ab5617)和Dnmt1抗體(OAEB01589)抗體，購自AVIVA 生物有限公司；及相應免疫熒光二抗，均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 免疫熒光試驗 利用冰凍切片快速抗原修復液對組織切片進行修復，TBST洗片5 min，用4%多聚甲醛進行固定、洗片，組織上滴加免疫染色封閉液，濕盒中37 ℃封閉1 h，以減少非特異性染色；棄去封閉液滴加GnRH一抗(稀釋比例為1∶500)，濕盒中4 ℃孵育過夜，擦干后滴加對應的GnRH熒光二抗(稀釋比例為1∶200)，37 ℃孵育1 h；洗凈后滴加Dnmt1一抗(稀釋比例為1∶300)，4 ℃孵育過夜后，滴加對應的Dnmt1熒光二抗(稀釋比例為1∶60)，同時對組織進行復核染，滴加DAPI(工作液濃度1 μg/mL)室溫孵育5 min，用含抗熒光淬滅劑的封片液進行封片，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.4 數據處理 通過Olympus激光共聚焦顯微鏡配套ZEN軟件分析免疫熒光圖片并統計陽性細胞數量。應用SPSS 18.0統計軟件進行方差分析，用Duncan′s法進行多重比較確定各組之間的差異顯著性，以P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 Dnmt1和GnRH在下丘腦中POA的表達和分布 如圖1所示，在母羊下丘腦中POA均有Dnmt1和GnRH表達，且呈現共表達模式。陽性細胞數變化如圖2，初情期前期和臨近初情期下丘腦陽性細胞數差異不顯著(P>0.05)，初情期陽性細胞數顯著低于初情期前期和臨近初情期(P<0.05)。

2.2 Dnmt1和GnRH在下丘腦中ARC的表達和分布 如中插彩版圖3所示，在下丘腦ARC核團中均有Dnmt1和GnRH表達，且兩者呈現共表達模式。陽性細胞數變化如圖4，初情期前期和臨近初情期陽性細胞數差異不顯著(P>0.05),初情期陽性細胞數顯著高于初情期前期和臨近初情期(P<0.05)

圖2 Dnmt1與GnRH共表達陽性細胞數統計

*：差異顯著(P<0.05)

圖4 母羊初情期啟動過程中弓狀核Dnmt1與GnRH共表達陽性細胞數統計

*：差異顯著(P<0.05)

3 討論

初情期啟動受下丘腦中樞調控，下丘腦分泌GnRH作用于垂體前葉，使其分泌促性腺激素刺激卵泡發育，性腺類固醇激素也可反饋到下丘腦控制GnRH分泌[6]。現已明確，下丘腦中視前區和弓狀核是GnRH分布的主要核團，也是GnRH接受雌激素反饋的重要位點[7]。現有研究表明，DNA甲基化作用可調節下丘腦初情期啟動關鍵基因的表達[6]。Dnmt1作為DNA甲基轉移酶負責新合成的DNA單鏈和半甲基化DNA鏈維持在5-mc模式[5]，其在初情期啟動過程中的作用尚不清楚。本試驗首次發現Dnmt1在下丘腦POA和ARC均有表達，主要分布于母羊下丘腦ARC，其與GnRH存在明顯的共表達，且初情期啟動時其共表達陽性細胞數量顯著增多。

本試驗結果表明，GnRH在初情期啟動過程中主要分布在下丘腦POA和ARC部位，這與以往研究結果一致。劉宵等發現，母羊出生后下丘腦各核團GnRH細胞數量隨月齡增長而增多[8]。Marta Wan′kowska等發現，在母羊初情期時POA中GnRH胞體數量減少[7]。目前有關Dnmt1在初情期啟動過程中的表達分布還鮮有報道，本研究發現，隨著初情期啟動，Dnmt1在母羊下丘腦的POA和ARC均有表達。本試驗還發現Dnmt1和GnRH在ARC和POA呈現共表達模式，且共表達水平在初情期啟動時最高，這提示Dnmt1可能通過調節GnRH表達量而參與母羊初情期啟動。現有研究表明，Roth CL等發現恒河猴初情期啟動時伴隨著Dnmt1表達量的下降[9]。Kurian J R等研究表明，恒河猴初情期GnRH啟動子區DNA甲基化水平降低[10-11]。

本研究僅通過免疫熒光標記技術檢測Dnmt1和GnRH在下丘腦ARC和POA存在共表達模式，尚不能明確其作用的分子機制，有待于進一步研究探索。