1株雞傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定及生物學特性研究

宋新宇 ， 張 青 ， 郭莉莉 ， 竇小龍 ， 趙 鵬 ， 郎 楓 ， 范根成

(動物基因工程疫苗國家重點實驗室 山東省畜禽動物疫苗重點實驗室青島市畜禽疫苗重點實驗室 青島易邦生物工程有限公司 ， 山東青島266114)

雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)是冠狀病毒科的雞傳染性支氣管炎病毒屬RNA病毒，該病毒基因組具有獨特的轉錄合成機制，再加上自然進化、多株免疫和高密度飼養等客觀因素造成野毒和疫苗毒大量長期共存，使得IBV極容易發生點突變、基因缺失、插入以及基因重組等，進而導致IBV不斷產生變異，新的血清型和基因型不斷出現[1、2]。目前，IBV的血清型已達26種之多，并仍有不斷上升的勢頭。而在實際生產中，免疫失敗的現象時有發生，使得傳染性支氣管炎成為禽病防治中難于控制的“頑癥”。因此,研究不同地區IBV的發生、進行血清學鑒定和分子病原學研究，一直是該病研究的焦點，對于從根本上控制傳染性支氣管炎具有重要意義。生物學特性研究不但對IBV分離株的鑒定提供了一種可靠的診斷方法，而且也是對分離株進一步研究的基礎。

為更好地服務市場，本公司一直跟蹤研究不同地區IBV的發生情況。本文針對2015年從江蘇某疑似傳染性支氣管炎雞群分離到的一株傳染性支氣管炎病毒，進行了初步鑒定及生物學特性研究。

1 材料

1.1 病料 2015年從江蘇某疑似傳染性支氣管炎雞群無菌采集發病雞氣管、腎臟和腺胃。

1.2 引物 參照GenBank收錄的IBV S1基因序列保守區域設計，由上海Invitrogen公司合成。如下所示：

上游引物S1-F∶5′-TATTGATTAGAGATGTTG GG-3′;

下游引物S1-R∶5′-CATAACTAACATAAGGGCAA-3′。

1.3 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒，購自TIANGEN公司；AMV反轉錄酶、TaqDNA聚合酶及RNA酶抑制劑，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 SPF種蛋 購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.5 SPF雞 SPF種蛋，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司，購回后在公司動物房孵化出雛，負壓隔離器內飼養。

1.6 試驗場地 青島易邦生物工程有限公司技術中心及動物房。

2 方法

2.1 病毒的分離 取發病雞氣管、腎臟和腺胃，用無菌生理鹽水勻漿制成20%懸液，每毫升加入2 000 IU青霉素、鏈霉素，反復凍融3次，3 000 r/min離心15 min，取上清除菌后經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，置37 ℃孵育觀察，孵化144 h，收毒。然后按此方法連傳5代。

2.2 分離株PCR鑒定及序列分析 取分離株第6代毒進行S1基因的RT-PCR擴增，序列測定與基因CenBank中的IBV序列進行比對和分析。

2.3 分離株毒價測定 將分離株第6代病毒液10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8 四個稀釋度，每稀釋度尿囊腔接種10日齡SPF雞胚各5枚，每胚0.1 mL，設同日齡未接種SPF胚5枚作對照，置36 ℃～37 ℃繼續孵育，每日照胚2次，剔除24 h以前的死胚，至144 h，取出所有活胚。接種后雞胚在24～144 h全部或部分死亡，存活雞胚胎兒出現失水、蜷縮、發育小(接毒胎兒比對照最輕胎兒重量低2 g以上)等特異性病痕判為感染，計算EID50。

2.4 無菌檢驗 取分離毒第6代，按2010年版《中國獸藥典》附錄[3]進行檢驗。

2.5 外源病毒檢驗 取分離毒第6代，按2010年版《中國獸藥典》附錄[3]進行檢驗。

2.6 分離株的血凝特性檢測 取分離株第6代病毒液先按2010年版《中國獸藥典》附錄[4]進行血凝效價測定；再將第6代病毒液經2個單位的卵磷脂酶C 37 ℃水浴2 h，檢測對雞紅細胞的凝集價，并用分離株的高免血清進行血凝抑制試驗。

2.7 分離株的部分理化特性檢測

2.7.1 耐熱性試驗 分離株病毒液56 ℃水浴分別處理30 min，經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，置37 ℃孵育觀察。

2.7.2 pH值穩定性試驗 分離株第6代毒在pH值3.0和pH值12.0環境下室溫作用3 h，經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，置37 ℃孵育觀察。

2.7.3 脂溶劑敏感試驗 分離株病毒液經氯仿、乙醚分別處理30 min，經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，置37 ℃孵育觀察。

2.7.4 胰蛋白酶穩定性試驗 分離株第6代毒經1%胰酶37 ℃處理1 h，經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚0.2 mL/枚，置37 ℃孵育觀察。

2.8 電鏡觀察 取分離株第6代病毒液，12 000 r/min(4 ℃)離心30 min，取其沉淀用2%磷鎢酸染色2 min，電鏡觀察病毒形態。

2.9 分離株的致病力試驗

2.9.1 對不同日齡SPF雛雞的致病力試驗 (1)人工感染試驗：用分離株強毒滴鼻104.0EID50/只，分別接種7、21、60日齡SPF雞，每個日齡10只，同時各日齡設10只不攻毒作空白對照。分別置于負壓隔離器中飼養，觀察試驗雞的發病情況；(2)病理學觀察：對人工感染7、21、60日齡試驗發病和死亡的雞進行系統的剖檢，觀察各臟器的病理變化；(3)病毒的分離：取人工感染試驗發病或死亡雞的氣管、腎臟用無菌生理鹽水勻漿成10%懸液，過濾除菌后經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，分離病毒。

2.9.2 最小致病量試驗 將分離株病毒液稀釋成104.0EID50、103.0EID50、102.0EID50、5×101.0EID50，分別滴鼻接種21日齡SPF雞，每組10只，隔離飼養，觀察試驗雞的生長和發病情況。觀察結束后進行剖檢，觀察各臟器的病理變化。分組及接種情況見表1。

表1 雞傳染性支氣管炎病毒分離株不同接種劑量攻毒分組情況

2.10 免疫原性試驗 將滅活的分離株病毒液與白油佐劑按1∶ 2比例制備油苗，以0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL和1.0 mL劑量免疫21日齡SPF雞各10只，肌肉注射。同時設同條件未免疫對照雞10只。免疫后21 d用分離株滴鼻攻毒，104.0EID50/只，攻毒后觀察14 d，記錄發病情況。

3 結果

3.1 病毒分離結果 將采集到的病料處理后接種10日齡SPF雞胚，盲傳6代，到第6代部分雞胚出現早期死亡，死亡雞胚全身出血明顯，未死雞胚發育受阻，呈明顯的侏儒胚、蜷縮胚變化；各代尿囊液HA效價呈陰性。

3.2 分離株S1基因RT-PCR擴增及分子進化樹分析結果 分離株S1基因RT- PCR擴增可見到清晰的1.7 kb左右大小的條帶，與引物設計的預期結果相符。從進化樹看，分離株屬于當前IBV主要流行的QX型。序列比對結果見圖1。

3.3 分離株毒價測定 取分離株第6代毒種測定病毒含量，結果顯示，分離株第6代病毒含量為106.1EID50/0.1 mL。

3.4 無菌檢驗結果 按2010年版《中國獸藥典》附錄進行檢驗，結果無菌生長。

圖1 分離株與GenBank中收錄的IB毒株S1基因分子進化樹

3.5 外源病毒檢驗結果

3.5.1 雞胚檢查法

3.5.1.1 尿囊腔途徑 雞胚均10/10存活，取雞胚液作血凝試驗，均為陰性。

3.5.1.2 絨毛尿囊膜途徑 雞胚均10/10存活，胎兒均發育正常，絨毛尿囊膜也無病變；取雞胚液作血凝試驗，均為陰性。

3.5.2 細胞檢查法 (1)細胞觀察：取2個方瓶(100 mL容量)的雞胚成纖維細胞(培養24 h左右)，接種病毒血清混合物0.2 mL，培養7 d，細胞均無病變；(2)紅細胞吸附試驗：結果紅細胞均被洗去，無紅細胞吸附現象。

3.6 分離株的血凝特性檢驗結果 按2010年版《中國獸藥典》附錄方法測定病毒液血凝效價為陰性，用卵磷脂酶C處理后HA為7log2，并能特異性地被分離株的高免血清所抑制。

3.7 理化特性測定結果

3.7.1 耐熱性試驗結果 56 ℃水浴30 min，分離株毒力幾乎不受影響。結果見表2。

3.7.2 pH值穩定性試驗結果 在室溫下進行，分離株對pH值3和pH值12均有不同程度的耐受力，分離株對pH值3的耐受力比pH值12好。結果見表2。

3.7.3 脂溶劑敏感性試驗結果 分離株對乙醚和氯仿均敏感。結果見表2。

3.7.4 胰蛋白酶穩定性試驗結果 分離株經胰蛋白酶處理后毒力略有下降。結果見表2。

表2 理化特性測定結果

-：表示測不到

3.8 電鏡觀察結果 將分離株第6代病毒液電鏡

觀察均可見到完整的病毒粒子，直徑80～120 nm，有囊膜、囊膜表面有纖突，頂部膨大，長約20 nm，突起末端呈球狀，整個突起呈梨狀，整個病毒呈皇冠狀，未見非目的病毒。見圖2。

圖2 分離株病毒液負染后經電鏡觀察可見到典型的冠狀病毒

3.9 分離株毒力試驗結果

3.9.1 對不同日齡SPF雛雞的致病力試驗結果

3.9.1.1 人工感染試驗結果 用分離株第6代病毒液接種7、21、60日齡SPF雞，接種后3～5日開始發病，先出現呼吸異常，拉稀，精神差，漸進性消瘦、死亡。見表3。

表3 分離株攻毒后發病死亡統計

3.9.1.2 剖檢病變觀察結果 7、21、60日齡SPF雞攻毒后病死雞的剖檢病理變化基本相同。腎臟腫大，有尿酸鹽沉積(呈花斑腎)，輸尿管、泄殖腔有尿酸鹽沉積；氣管有不同程度的出血，有黏液；肺臟不同程度出血；個別腺胃腫脹，腔上囊腫脹。對照雞無明顯變化。

3.9.1.3 病毒的分離結果 人工感染試驗中采集發病或死亡雞的氣管、腎臟組織制成懸液，在10日齡SPF雞胚中盲傳兩代，接種病毒后144 h可見明顯的侏儒胚、蜷曲胚。

3.9.2 分離株最小致病量試驗結果 用不同劑量分離株第6代毒分別接種21日齡SPF雞。結果顯示，不同劑量分離株攻擊21日齡SPF雞，104.0EID50攻擊10/10發病，6/10死亡；103.0EID50攻擊10/10發病，4/10死亡；102.0EID50攻擊8/10發病，3/10死亡；5×101.0EID50攻擊6/10發病，1/10死亡。發病雞臨床主要表現為精神沉郁、采食下降、羽毛蓬松、兩翅下垂、脫水，爪子發干，拉白色或水樣稀便，有不同程度的呼吸道癥狀、漸進性消瘦、死亡。不同劑量發病死亡雞病變基本一致，表現為腎臟腫大，有尿酸鹽沉積(呈花斑腎)，泄殖腔有尿酸鹽；氣管環有不同程度的出血，有黏液；個別雞腺胃腫脹，腔上囊腫脹。結果見表4。

3.10 免疫原性試驗結果 分離株滅活苗按不同劑量免疫后，免疫組0.25 mL/只～1.0 mL/只保護8/10～10/10，對照組發病8/10。結果見表5。

4 討論

4.1 大量的流行病學監測結果顯示，近年來國內流行的IBV毒株處于持續不斷的進化當中，根據韓宗璽等[4]對1995-2009年共計15年間國內可檢索到S1基因全長序列的所有IBV分離株進行的遺傳進化分析，結果顯示，國內至少同時流行10個以上基因型的IBV毒株，但QX型(也稱LX4型)為最主要的優勢基因型(54.1%)。根據最近的研究報道，在2009年以后的國內分離株中，QX型毒株所占的比重至少在75%以上[5-8]。QX型原型株QX株最早于1996年分離自青島某發生腺胃炎的雞群[9]，但直到2004年該型病毒才被證實在國內廣泛流行，臨床表現主要為腎病變型[10]；而同期包括俄羅斯、荷蘭、比利時、德國、法國等在內的多個歐洲國家也在同一時期發現存在該型毒株的流行，但臨床表現主要是與引起“假母雞”有關[11]。另外張小榮、劉勝旺等人的研究結果，說明2018年流行的IBV也主要是以QX型為主[12-13]。目前國內尚無上市的IBV QX型疫苗。

表4 分離株的最小致病量試驗結果

表5 免疫效力試驗結果

4.2 為跟蹤市場IB流行情況，研制新的疫苗，我們不斷從各地分離IBV。本文針對2015年我們從江蘇某疑似IB的雞場分離到一株病毒進行鑒定。結果電鏡觀察可見直徑為80～120 nm，有囊膜和纖突的冠狀病毒粒子。分離株對熱、酸、堿和胰蛋白酶均有一定的耐受力，對脂溶劑敏感。與賀秀媛等人的研究結果相一致[14]。這符合傳染性支氣管炎病毒具有囊膜這一特征。

4.3 從進化樹分析，該分離株屬于當前主要流行的QX型，與張小榮、劉勝旺等[12-13]人的研究結果相一致。我公司跟蹤市場調研結果結合張小榮、劉勝旺等人的研究結果分析，IBV當前除主要的QX型外還有HN-08型、LSC/99I型、LDT3/03型、TW-I型、Mass型、CH VI型、TW-II型和793/B型等。說明國內IBV是在不斷變異的。

4.4 該分離株致病力結果顯示，人工攻毒后，臨床能復制出典型的病例，發病雞主要表現呼吸異常、拉稀、精神差、漸進性消瘦、死亡等。剖檢發病雞腎臟腫大，有尿酸鹽沉積(呈花斑腎)，輸尿管、泄殖腔有尿酸鹽沉積；氣管有不同程度的出血，有黏液；肺臟不同程度出血；個別腺胃腫脹，腔上囊腫脹。102.0EID50/只的分離株攻擊能達到80%的發病率，因此分離株的最小致病量定為102.0EID50/只。考慮到實際應用中各種因素對病毒的影響，為保證攻毒結果成立，攻毒劑量采用最小致病量的2倍劑量，即為104.0EID50/只。分離株對不同日齡SPF雞的致病力不同，日齡越小，發病率和死亡率越高。說明該分離株是株致病性比較典型的IBV。

4.5 該分離株免疫原性試驗結果顯示，分離株滅活疫苗按0.25 mL/只～1.0 mL/只免疫21日齡SPF雞保護達8/10～10/10，從試驗結果看，0.25 mL/只即可達到良好的免疫效果。說明該毒株具有良好的免疫原性。

綜合以上試驗結果，該分離株即有良好的免疫原性，又能復制出典型病例。說明該毒株是個不錯的傳染性支氣管炎病疫苗候選株。這為后期產品開發奠定了基礎。