ATF4過表達對HepG2細胞凋亡的影響及其機制

肖婷焱 段無暇 許紫薇 周壽紅 曾斌

[摘要] 目的 觀察轉錄激活因子4（ATF4）過表達對人肝癌HepG2細胞凋亡的影響，并探討其機制。 方法 構建ATF4表達質粒，采用脂質體瞬時轉染HepG2細胞。實驗分為空白對照組、空質粒組和ATF4質粒組。采用流式細胞術檢測細胞凋亡率，檢測HepG2細胞培養液中乳酸含量，Western blot檢測Warburg效應蛋白M2型丙酮酸激酶（PKM2）的表達。 結果 與空質粒組比較，ATF4質粒組HepG2細胞凋亡率顯著增加，細胞培養液中乳酸含量顯著降低，HepG2細胞中PKM2蛋白的表達顯著下調（均P < 0.05）。 結論 過表達ATF4促進HepG2細胞的凋亡，其機制可能與抑制Warburg效應有關。

[關鍵詞] 肝細胞性肝癌；細胞凋亡；轉錄激活因子4；Warburg效應；M2型丙酮酸激酶

[中圖分類號] R34 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）07（a）-0012-05

Effect and mechanism of overexpression of ATF4 on the apoptosis of HepG2 cells

XIAO Tingyan1 DUAN Wuxia1 XU Ziwei1 ZHOU Shouhong2 ZENG Bin1

1.Department of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of University of South China， Hu'nan Province， Hengyang 421001， China； 2.Teaching and Research Office of Physiology， Medical College， University of South China， Hu'nan Province， Hengyang 421001， China

[Abstract] Objective To observe the effect of overexpression of activating transcription factor 4 （ATF4） on the apoptosis of HepG2 cells and explore the mechanism. Methods ATF4 expression plasmid was built. Hepatocellular carcinoma line HepG2 cells were transfected with ATF4 expression plasmid through liposome. The plasmids were divided into blank control group， empty plasmid group and ATF4 plasmid group. The apoptosis rate was detected by flow cytometry. The content of lactate in cell culture medium was tested. The expression of Warburg effect protein pyruvate kinase subtype M2 （PKM2） was measured by Western blot. Results Compared with the empty plasmid group， the apoptosis rate of HepG2 cells increased significantly， the content of lactate in cell culture medium decreased significantly and the expression of PKM2 decreased significantly （all P < 0.05）. Conclusion Overexpression of ATF4 promotes the apoptosis of hepatocellular carcinoma line HepG2 cells， the mechanism may be related to inhibition of Warburg effect.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； Apoptosis； Activating transcription factor 4； Warburg effect； Pyruvate kinase subtype M2

肝細胞癌（簡稱“肝癌”）是原發性肝癌的主要類型，其發病率近年來持續攀升，已經成為全球第二大致命性癌癥[1-2]。轉錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）是ATF/CREB家族的成員之一，能夠調控適應性關鍵基因的轉錄，參與氨基酸的合成與運輸、糖脂代謝及整合應激反應等多種生物學功能[3-4]。ATF4通路在誘導腫瘤細胞凋亡、調節腫瘤自噬中起著關鍵作用[5-6]。Warburg效應是腫瘤細胞獨特的能量代謝方式，M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase subtype M2，PKM2）是最重要的一種Warburg效應相關蛋白，在大多腫瘤細胞中呈高表達[7]。本研究旨在探討過表達ATF4下調Warburg效應相關蛋白PKM2表達及對人肝癌HepG2細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株及試藥

人肝癌細胞系HepG2（南華大學微生物研究所）。二甲基亞砜（杭州四季青公司，批號：171014）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司，批號：1705567）；ATF4質粒及空載質粒（上海吉凱基因公司，批號：170506）；質粒小提試劑盒（北京天根生物技術公司，批號：1701016）；Loading-Buffer上樣緩沖液（北京碧云天生物技術公司，批號：ST506）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京碧云天生物技術公司，批號：G1712）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（北京碧云天生物技術公司，批號：p0017s）；流式細胞凋亡檢測試劑盒（北京聯科生物技術公司，批號：170513）；L-乳酸鹽檢測試劑盒（北京九強生物有限公司，批號：170621）；PKM2兔抗人單克隆抗體（美國Cell Signaling公司，批號：170-21）；GAPDH兔抗人單克隆抗體（北京博奧森有限公司，批號：bs-0061R）；辣根標記山羊抗兔IgG（北京博奧森有限公司，批號：Zbs0175R）；辣根標記山羊抗鼠IgG（北京博奧森有限公司，批號：Zbs0175R）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 使用1640培養基培養人肝癌細胞HepG2，培養基含10%胎牛血清。培養條件：37℃，5%CO2。每1～2天進行細胞換液，當細胞融合度達80%～90%時，進行細胞傳代、細胞凍存或用于后續實驗。實驗分為空白對照組、空質粒組和ATF4質粒組。

1.2.2 ATF4過表達質粒的構建及質粒DNA提取 ATF4過表達質粒由上海吉凱基因化學技術有限公司構建，載體名稱為GV362。元件順序：CMV-MCS-3FLAG-IRES-EGFP-SV40-Neomycin；克隆位點：XhoI/BamHI；對照編號：CON236。ATF4過表達質粒構建好后，對目的基因進行陽性克隆測序分析，證明成功構建ATF4表達質粒。以LB粉劑加入一級水配制成LB液，高壓蒸汽滅菌備用。細菌操作臺內將卡那霉素加入上述LB培養液中。以含質粒（ATF4或空質粒）的菌液分別加入LB培養液中，37℃、180 r/min搖床上震蕩培養16 h。按質粒小提試劑盒中操作說明進行提取純化質粒用于后續實驗。

1.2.3 細胞轉染 HepG2細胞按106個/孔接種于6孔板中，含10%胎牛血清1640培養基培養，待細胞均勻鋪滿孔板90%時轉染。去培養液，PBS沖洗2遍。配制轉染混合液：A液為4 μg ATF4表達質粒（或空質粒載體）用無血清1640培養基稀釋成250 μL。B液為10 μL Lipofectamine 2000用無血清1640培養基稀釋成250 μL。B液靜置5 min后，混合A液和B液，混合后靜置20 min后成為轉染混合液。將上述轉染混合液按分組加入6孔板內，輕輕晃動混勻，放入培養箱內孵育4～6 h后，PBS清洗2遍，加入含10%小牛血清的1640培養基后，置于培養箱中繼續培養。48 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況，并計算轉染率。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI染色和流式細胞術檢測細胞凋亡 采用Annexin V-PE/7-AAD熒光染色法檢測細胞凋亡。收集各組HepG2細胞于離心管中，離心半徑為55 mm，1000 r/min，離心5 min，棄上清，冷PBS洗滌2次，調整細胞密度為1×106/mL，將細胞懸于1×結合緩沖液中，加5 μL Annexin V-PE和10 μL 7-ADD，輕輕混勻冰上避光反應15 min，加380 μL冷的1×結合緩沖液，重復3次，上機檢測。每次計細胞數6000個，記錄激發波長488 nm處紅色熒光，流式細胞儀分析不同DNA含量的細胞分布，用分析軟件CellQuest檢測凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測PKM2蛋白表達 HepG2細胞經轉染48 h后加入含PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30～40 h，離心半徑為30 mm，14 000 r/min離心10 min，收集上清液。BCA法定量蛋白濃度。RIPA裂解液稀釋、配平蛋白，加入Loading-Buffer上樣緩沖液。PCR儀中99℃、10 min煮沸使蛋白變性。配制好SDS-PAGE凝膠，加入適量蛋白樣品至加樣孔后電泳。切出目的膠并裁剪相應的PVDF膜，以150 mA恒定電流將目的蛋白轉至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h。一抗anti-ATF4（1∶2000）、anti-PKM2（1∶1000）和anti-GAPDH（1∶2000）孵育過夜。二抗孵育2 h。顯影。采用Image J軟件處理結果并進行數據分析。

1.2.6 L-乳酸鹽檢測試劑盒檢測細胞培養液內的乳酸分泌量 HepG2細胞按105個/孔接種于24孔板中，培養貼壁，每組設置8個復孔，轉染48 h后備用。分別收集各孔細胞培養液樣品，按乳酸檢測試劑盒操作說明檢測各樣本中的乳酸含量（mmol/L），記錄數據結果。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0對實驗數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多個樣本間的數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 過表達ATF4的HepG2細胞系的建立

光鏡下可見轉染后的HepG2細胞形態正常，具有良好的透光度，沒有出現明顯的大片細胞死亡以及細胞碎片的形成。熒光顯微鏡下可見轉染組EGFP陽性細胞數明顯增加，轉染效率達到（84.56±5.83）%。見圖1。

2.2 過表達ATF4對肝癌細胞HepG2凋亡的影響

與空質粒組比較，ATF4質粒組的HepG2細胞凋亡率顯著升高（P < 0.05），而空質粒組與空白對照組細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖2。

2.3 過表達ATF4對HepG2細胞培養液中乳酸含量的影響

與空質粒組比較，ATF4質粒組HepG2細胞培養液中乳酸含量顯著減少（P < 0.05），而空質粒組與空白對照組HepG2細胞培養液中乳酸含量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖3。

2.4 過表達ATF4對HepG2細胞中PKM2蛋白表達的影響

與空質粒組比較，ATF4質粒組HepG2細胞中PKM2蛋白的表達水平顯著下調（P < 0.05），而空質粒組與空白對照組HepG2細胞中PKM2蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖4。

3 討論

肝癌的發生發展受肝癌細胞本身、肝癌與微環境之間相互作用等多方面因素的影響，肝癌的發生伴隨著細胞形態變化、功能缺失及細胞代謝的顯著改變等[8-10]。ATF4是一種未折疊反應蛋白，參與多種細胞生物學功能，其主要功能包括氨基酸的合成與運輸、能量代謝、糖脂代謝及整合應激反應等[11]。研究發現ATF4參與調節腫瘤細胞凋亡，影響著腫瘤細胞的發生發展[12]。研究表明，ATF4過表達能誘導大腸癌細胞發生凋亡[13]。Lee等[14]發現，內質網應激時，ATF4能夠調節黃猩猩果蠅細胞的糖酵解相關基因的表達。研究表明，過表達ATF4基因的裸鼠橫紋肌肉瘤成瘤體積小于野生型裸鼠，表明ATF4能誘導腫瘤細胞發生凋亡，其作用機制可能與誘導下游基因ANSN表達有關[15]。本研究結果發現，ATF4過表達可促進肝癌HepG2細胞發生凋亡。但是ATF4的作用機制尚不完善，其作為未折疊蛋白因子影響腫瘤細胞的功能已經比較明確，但ATF4在通過調節代謝通路而影響腫瘤方面的作用尚不清楚，因此，ATF4作為腫瘤代謝調控因子的功能有待進一步探討。

Warburg效應是腫瘤細胞代謝的主要標志之一，即細胞在氧充足的條件下仍以糖酵解為主產生大量乳酸。許多腫瘤組織中都能觀察到Warburg效應，包括肝癌、結腸癌、肺癌、惡性膠質細胞瘤等[16]。研究顯示，下調Warburg效應相關蛋白的表達能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞凋亡[17]。Warburg效應能夠促進腫瘤細胞增殖，有氧糖酵解影響腫瘤發展、遷移及治療等多方面，抑制腫瘤細胞的有氧糖酵解表型能夠促進腫瘤細胞凋亡[18]。

Warburg效應包括丙酮酸激酶等酶基因在內的多個作用靶點，這些作用位點統稱為Warburg效應相關蛋白，調節這些酶基因表達都能直接影響Warburg效應。丙酮酸激酶有四種表型，PKM2是其中最主要的腫瘤表型。通常來說，PKM1主要存在于非增生性組織中，而PKM2則為增殖性組織中所特有。PKM1向PKM2表型的轉換是PKM2在許多癌癥細胞中呈高表達的主要原因，這說明Warburg效應相關蛋白PKM2具有致瘤性。研究顯示，PKM2促進結腸癌細胞的增殖及遷移，并且能夠介導Warburg效應的建立，是Warburg效應的重要標志物[19-20]。然而ATF4是否對腫瘤Warburg效應有調節作用尚未見報道。本研究結果發現，過表達ATF4可下調HepG2細胞PKM2的表達，減少肝癌HepG2細胞乳酸生成，表明過表達ATF4可抑制肝癌HepG2細胞Warburg效應。因此推測過表達ATF4可促進肝癌HepG2細胞凋亡的機制可能與抑制Warburg效應有關。

[參考文獻]

[1] Marquardt JU，Andersen JB，Thorgeirsson SS. Functional and genetic deconstruction of the cellular origin in liver cancer [J]. Nat Rev Cancer，2015，15（11）：653-667.

[2] 紀龍珊，孫學華，周振華，等.肝細胞核因子4α與肝細胞癌關系的研究進展[J].中國醫藥導報，2018，15（2）：32-35.

[3] Teske BF，Wek SA，Bunpo P，et al. The eIF2 kinase PERK and the integrated stress response facilitate activation of ATF6 during endoplasmic reticulum stress [J]. Mol Biol Cell，2011，22（22）：4390-4405.

[4] Rouschop KM，van den Beucken T，Dubois L，et al. The unfolded protein response protects human tumor cells during hypoxia through regulation of the autophagy genes MAP1LC3B and ATG5 [J]. J Clin Invest，2010，120（1）：127-141.

[5] Rozpedek W，Pytel D，Mucha B，et al. The Role of the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP Signaling Pathway in Tumor Progression During Endoplasmic Reticulum Stress [J]. Curr Mol Med，2016，16（6）：533-544.

[6] Chir WB，Maurin AC，Carraro V，et al. The eIF2α/ATF4 pathway is essential for stress-induced autophagy gene expression [J]. Nucleic Acids Res，2013，41（16）：7683-7699.

[7] Liu T，Yin H. PDK1 promotes tumor cell proliferation and migration by enhancing the Warburg effect in non-small cell lung cancer [J]. Oncol Rep，2017，36（1）：193-200.

[8] 周彬，陳志浩，宮緒萌，等.骨髓干細胞移植治療肝細胞癌的研究進展[J].中國醫藥導報，2014，11（22）：151-153.

[9] Hutter LH，Rata S，Hochegger H，et al. Interlinked bistable mechanisms generate robust mitotic transitions [J]. Cell Cycle，2017，16（20）：1885-1892.

[10] 孫丹妮，黃洵.NF-κB在肝細胞癌發生發展中的作用及其機制研究進展[J].中國醫藥導報，2016，13（18）：42-45.