長鏈非編碼RNA GC lnc1對胃癌MGC-803細胞增殖和遷移的作用

任瑞平，張昱，袁祖國

（寧波市鄞州人民醫院，浙江 寧波 315040）

長鏈非編碼RNA（Lnc RNA）被認為可以調節癌細胞的生長、凋亡和轉移[1]。研究證明，Lnc RNAs、HOTAIR、MEG3、MALAT1、H19 和 GAPLINC 與 胃癌的發病和發展密切相關[2-6]。然而尚無研究涉及Lnc RNA GC lnc1在胃癌中的發病機制。本研究利用慢病毒轉染技術構建Lnc RNA GC lnc1的干擾載體，探究Lnc RNA GC lnc1對胃癌細胞增殖、遷移和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清購自Gibco公司；DMEM及0.25%胰酶Trypsin購自美國Invitrogen公司；TRIZOL購自美國Invitrogen公司；氯仿、酒精（濃度為75%）及逆轉錄試劑盒購自美國ABI Applied Biosystems公司；Real-time PCR儀購自美國biorad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 胃癌細胞系MGC-803的培養 培養人胃癌細胞系MGC-803為靶點種子細胞，購自中科院上海細胞研究院。經離心收集后，以2×104/cm2的密度將其種植于25cm×25cm的培養瓶中。加入含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養液 （Gibco-BRL，Gaithersburg，MD）進行培養。

1.2.2 構建Lnc RNA GC lnc1的過表達載體Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干擾載體由上海吉凱公司合成，選擇pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作為質粒的克隆載體。慢病毒RNAi干擾載體的克隆切入點是XhoI/BamHI，編號為ENST00000003424。經過基因測序證明序列的正確性。

1.2.3 胃癌細胞的分組與干預措施 將胃癌細胞分成3組，即空白對照組、空白病毒載體對照組和RNAi干擾載體組。空白對照組是未做任何處理的細胞，空白病毒載體對照組是經空白載體的慢病毒轉染的細胞組，RNAi干擾載體組是由Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干擾載體構建的慢病毒轉染細胞。以ZsGreen為慢病毒熒光探針，用熒光顯微鏡觀察細胞慢病毒的轉染效率。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 三組細胞融合率達80%，0.25%胰蛋白酶消化后放入15mL離心管，加入 1mL 的 Trizol RNA iso （Takara，日本），提取總RNA，根據Takara逆轉錄試劑盒說明書，檢測總RNA的純度為1.9～2.0。逆轉錄cDNA保存在4℃冰箱中備用。根據TaKaRa熒光定量PCR試劑盒的說明書要求，采用20μL的反應體系，加入各樣品，進行熒光定量PCR的檢測。采用FS2000系統對PCR進行分析，反應條件預設為預變性：95℃30秒，1個循環。 PCR：95℃ 5秒，60℃ 30秒，40個循環。溶解曲線：95℃5秒，60℃ 1分鐘。降溫：50℃30秒，1個循環。內參基因GAPDH和凋亡相關基因Caspase-3、Caspase-9引物由上海生工公司生產（表1）。采用2-△△CT的方法計算目的基因的相對表達量。

表1 目的基因的引物序列

1.2.5 Transwell小室實驗檢測腫瘤細胞的遷移三組細胞經胰蛋白酶消化后收集，按照試劑盒的說明書，將基底膜的基質原液放在冷藏冰箱（4℃）過夜融化，然后與預冷的無血清RPMI-1640按照1:3的比例配置侵襲上室凝膠液體，以每孔55μL量包被Transwell小室的上室，放置在37℃的孵育箱，2小時后使上室成膠。然后上室每孔接種200μL不含血清的細胞培養液，下室加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養液500μL。將Transwell板放置在37℃的孵育箱中培養24小時后用結晶紫染色，再將Transwell板用倒置光學顯微鏡拍照并且進行細胞計數。所有實驗均重復3次。

1.2.6 CCK-8實驗檢測腫瘤細胞的增殖 三組細胞經胰蛋白酶消化后收集，按照CCK-8試劑盒說明書[16]將三組轉染后的細胞接種在96孔板中，轉染細胞以每孔5000個/100μL接種，72小時后每孔加入10μL CCK-8的試劑，放至37℃的孵育箱中培養2小時。然后用酶標儀在450nm波長處測定吸光度。

1.3 統計學處理 應用SPSS 16.0軟件進行統計學處理，結果用±s）形式表示。多組間計量資料采用方差分析，兩組間比較再采用q檢驗。

2 結果

2.1 Lnc RNA GC lnc1的慢病毒RNAi干擾載體的構建和轉染 以ZsGreen為熒光蛋白為熒光探針，Lnc RNA GC lnc1慢病毒轉染效率較高，以胃癌MGC-803細胞為靶點種子細胞，慢病毒轉染率為94%，Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干擾載體的滴度為1×108TU/mL。詳見圖1。

圖1 Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干擾載體的構建和轉染。1A：0.11μL慢病毒轉染胃癌MGC-803細胞的熒光下視野；1B：0.033μL慢病毒轉染胃癌MGC-803細胞的熒光下視野；1C：0.11μL慢病毒轉染胃癌MGC-803細胞的白光下視野；1D：0.033μL慢病毒轉染胃癌MGC-803細胞的白光下視野。

2.2 凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的表達RT-qPCR檢測三組間凋亡基因Caspase-3，Caspase-9的表達水平，差異均有統計學意義 （F=17.927，P＜0.05 和 F=15.117，P＜0.05）。 同時，Caspase-3、Caspase-9兩個指標，RNAi干擾載體組與空白對照組、與空白載體病毒組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。 詳見表 2。

表2 三組Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達水平（±s）

表2 三組Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達水平（±s）

與空白對照組、與空白載體病毒組比較*P＜0.05

組別 n Caspase-3 Caspase-9空白對照組 3 1.001±0.002 1.001±0.003空白載體病毒組 3 1.231±0.112 1.112±0.007 RNAi干擾載體組 3 2.247±0.729* 3.047±0.432*

2.3 細胞的遷移和增殖 Transwell實驗結果顯示，透過分子篩的細胞數三組之間比較差異有統計學意義（F=31.982，P＜0.01），其中 RNAi干擾載體組與空白對照組、與空白載體病毒組比較透過分子篩的細胞數顯著降低，差異具有統計學意義 （均P＜0.05）。CCK-8檢測結果顯示，三組細胞增殖率差異有統計學意義（F=23.983，P＜0.05），其中 RNAi干擾載體組與空白對照組、與空白載體病毒組比較細胞增值率顯著降低，差異具有統計學意義 （均P＜0.05）。 詳見表 3。

表3 三組細胞增殖率比較

3 討論

非編碼RNA（Lnc RNA）本身不具有編碼蛋白，是不具有轉錄功能的RNA分子，長度不超過200個片段[7]。更重要的是，Lnc RNAs已經被證實在腫瘤細胞的發生和發展、增殖和侵襲中起重要的作用[8]。既往研究表明，Lnc RNA在肺癌、前列腺癌、結腸癌和肝癌等腫瘤細胞中具有重要的轉錄因子作用[9]，并且與腫瘤的大小和臨床分期密切相關[10-12]。本研究主要探討Lnc RNA GC lnc1在胃癌細胞的增殖侵襲和凋亡中的作用。

Caspase家族是近年來細胞凋亡領域中分子生物學研究的重要發現之一，在凋亡的最后階段是通過Caspase家族的激活和表達而實現的[13]，其中Caspase-3和Caspase-9是Caspase家族中與凋亡密切相關的蛋白酶，并且與胃癌細胞的凋亡有密切關系[14-15]。

本研究通過RT-qPCR方法檢測了Lnc RNA GC lnc1在胃癌細胞中凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平的表達，發現RNAi干擾載體組與空白對照組、與空白載體病毒組比較均顯著升高（均 P＜0.05），提示 Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干擾載體可促進胃癌細胞的凋亡。

通過Transwell實驗發現，RNAi干擾載體組與空白對照組、與空白載體病毒組比較，透過分子篩的細胞數顯著降低（均P＜0.05），說明Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干擾載體在胃癌細胞的遷移中具有明顯的抑制作用。

此外，本研究還利用CCK-8實驗檢測腫瘤細胞的增殖，結果顯示RNAi干擾載體組與空白對照組、與空白載體病毒組比較細胞增殖率顯著降低（均P＜0.05）。從而說明Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干擾載體在胃癌細胞的增殖中具有明顯的抑制作用。

綜上，Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干擾載體在胃癌細胞的過度凋亡具有明顯的促進作用，對腫瘤細胞的遷移和增殖具有明顯的抑制作用，但具體起作用的分子生物學機制需進一步研究。