MTHFR C677T基因多態性對干預Hhcy后腦梗死復發的影響

劉海艷 魏秀娥 榮良群 許 靜 楊 華 張翠翠

徐州醫科大學第二附屬醫院神經內科，江蘇 徐州 221006

近年來多項研究認為，高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，Hhcy)是缺血性腦血管病新的獨立危險因素[1-3]。5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)再甲基化途徑中的一項重要物質，MTHFR基因突變可導致Hhcy[4]，大量的研究也認為MTHFR基因C667T突變與缺血性腦血管病密切相關[5-10]。然而，對合并Hhcy腦梗死患者進行Hhcy干預是否能降低卒中復發風險目前尚有爭議[11-13]，結局是否受MTHFR677TT基因型的影響也不清楚。本研究對伴Hhcy的腦梗死患者給予標準二級預防治療或標準治療及干預Hhcy，觀察1 a不同MTHFR677位基因型腦梗死患者缺血性卒中復發情況，以期為伴Hhcy腦梗死患者二級預防的個體化治療方案提供依據。

1 資料與方法

1．1臨床資料選擇2012-09—2014-09徐州醫科大學第二附屬醫院神經內科Hcy>15 μmol/L的 2個月內新發363例腦梗死患者，腦梗死診斷符合全國第4屆腦血管病學術會議修訂的診斷標準，排除心源性卒中患者，年齡>20歲。

1．2治療方法采用前瞻平行對照方法將研究對象分為2組，A組：標準二級預治療及干預HHcy組180例(葉酸 5 mg/d，維生素B625 mg/d，維生素B120.5 mg/d)；B組：標準二級預防組183例。對入組患者進行MTHFR677位基因檢查，分為CC型、CT型、TT型。隨訪1 a，終點事件為缺血性腦卒中復發。

詳細記錄性別、年齡、文化程度等人口學資料以及抽煙史、飲酒史、卒中史、高血壓史、糖尿病史、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病史、血糖、血脂、肌酐、Hcy水平等血管病危險因素以及MTHFR677位基因型、影像學資料。檢測患者入組時、1 a血漿Hcy以及血糖、血脂、腎功能等生化指標；記錄患者入組時、干預后1 a神經病學狀況及影像學資料，觀察腦卒中復發。神經影像評定采用1.5T磁共振常規T1、T2、Flair、DWI成像、MRA。

1．3血樣采集Hcy水平測定采用競爭免疫法酶測定Hcy，>15 μmol/L為Hhcy。

1．4 MTHFR基因多態性分析采用多聚酶鏈反應-限制性內切酶片段長度多態性( PCR-RFLP)技術檢測MTHFR基因型。用血液DNA基因試劑盒提取基因組DNA，MTHFR擴增引物序列參考文獻，PCR反應體系50 μL常規配制，擴增MTHFR基因的反應條件為：94 ℃變性5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環30個周期，72 ℃延伸7 min；取10 μL的PCR產物，Hinf Ⅰ限制性內切酶6 U，加雙蒸水至20 μL，37 ℃消化3 h，2%瓊脂糖凝膠電泳判斷酶切結果。可見MTHFR有3種基因型：TT純合型，酶切后含有174 bp及72 bp 2種片段；CT雜合型，有246 bp、174 bp和72 bp 3種片段；CC野生型，僅有246 bp片段。見圖1(1為Marker，5為CC野生型，4、7為CT雜合型，2、3、6為TT(純合型)。

2 結果

2．1 3種基因型比較CC型111例，CT型153例，TT型99例，分別占30.58%、42.14%、27.27%。3組間比較，年齡、抽煙、飲酒、糖尿病、血漿膽固醇、LDL、血糖差異無統計學意義(P>0.05)；3組高血壓比例、Hcy水平有明顯的不同，差異有統計學意義(P<0.05)；進一步兩兩比較發現，TT型患者高血壓比例、Hcy水平明顯較其他兩型高，其他兩型高血壓比例以及Hcy水平無明顯差異。

圖1 MTHFR基因PCR產物酶切圖Figure 1 MTHFR gene PCR product cleavage map

表1 三種不同基因型腦梗死患者基線比較Table 1 Baseline comparison of three different genotypes of patients with cerebral infarction

2．2 3種基因型腦卒中復發情況CC基因型患者中標準治療+干預Hhcy組56例，1 a卒中復發11例，復發率19.64%；標準治療組55例，1 a卒中復發12例，復發率21.8%，兩種治療方案間卒中復發率比較差異無統計學意義。CT基因型患者中標準治療+干預Hhcy組76例，1 a卒中復發14例，復發率18.42%；標準治療組77例，1 a卒中復發15例，復發率19.5%。兩種治療方案間卒中復發率比較差異無統計學意義。TT基因型患者中標準治療+干預Hhcy組49例，1 a卒中復發5例，復發率10.20%；標準治療組50例，1 a卒中復發13例，復發率26%，兩種治療方案間卒中復發率比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2．3 MTHFR677TT患者卒中復發單因素分析MTHFR677TT患者兩種不同治療方案卒中復發率差異明顯，單因素分析結果顯示，性別、抽煙、飲酒、膽固醇水平、LDL、Hcy水平在2組間無明顯差異(P>0.05)；年齡、高血壓、糖尿病、干預Hhcy治療在2組間差異有統計學意義(P<0.05)。

2．4 TT基因型患者缺血性卒中復發的多因素分析為進一步明確TT基因型患者干預Hhcy對缺血性卒中復發的影響，排除各危險因素影響相互關系，將年齡、高血壓、糖尿病、干預Hhcy作為自變量，缺血性卒中再發為應變量，進行逐步條件Logistic回歸分析，結果發現高血壓、糖尿病均是TT型缺血性卒中復發的獨立危險因素，而干預Hcy是卒中復發的保護性因素，OR值分別為0.678，95%CI0.424～0.961，P<0.05。見表4。

3 討論

研究發現，Hhcy增加卒中復發風險[14-15]。MTHFR是Hcy代謝關鍵酶之一，研究顯示MTHFRC677T 突變可導致MTHFR酶活性下降，其中CT型、TT 型人群的酶活性分別為C/C型的65%和30%，因此 TT 型人群可能最易患Hhcy。一項薈萃分析[4]證實 MTHFR 677位TT基因型人群比CC/CT基因型人群有更高的Hcy。LI等人[5]的薈萃分析發現MTHFR677位TT的基因型是缺血性卒中的危險因素，攜有TT基因型患者腦卒中的風險增加(OR=I.43，95%CI：1.20～1.70)。 國內學者研究[16]發現卒中復發患者T型基因攜帶比例較新發中青年卒中患者高，提示TT型基因是腦梗死復發的危險因素，在中青年卒中人群中也有類似結果[17]。但目前伴Hhcy腦梗死患者進行Hhcy干預是否能降低卒中復發風險尚無明確的定論，結果是否受MTHFR677TT基因型的修飾也不清楚。

本研究顯示，MTHFR677TT基因型患者Hcy水平明顯高于其他兩型，CC與CT型患者Hcy水平大致相同，與TT基因型MTHFR酶活性下降70%有關。本研究也顯示，TT基因型伴高血壓比例更高，符合中國高血壓特點。研究發現，中國高血壓患者50%以上伴Hhcy[9]，且約24%高血壓患者攜帶MTHFRTT基因型[18]。在1 a隨訪期中，本研究顯示，MTHFR677不同基因型干預Hhcy與未干預Hhcy比較，缺血性腦卒中復發情況不同。CC與CT型患者中，干預Hhcy與不干預Hhcy缺血性腦卒中復發率無明顯差異；而在TT型患者中，干預Hhcy后缺血性腦卒中復發率較未干預Hhcy的低。為進一步了解MTHFR677TT型缺血性腦卒中復發可能的影響因素，對卒中復發未復發進行單因素分析，結果顯示，年齡、高血壓、糖尿病、干預Hhcy 2組間有明顯差異；進一步多因素Logistic回歸分析顯示，干預Hhcy是卒中復發的保護性因素，提示對于MTHFR677TT基因型患者控制Hhcy水平卒中復發風險下降，可能獲益更大。HOLMES等[4]的Meta分析顯示，在葉酸水平較低亞洲人群中，MTHFR TT基因型增加缺血性腦卒中風險更明顯(OR=1.68，95%CI1.44～1.97)，降低Hcy對卒中預防作用會更大(RR=0.78，95%CI0.68～0.90)，提示干預Hhcy對卒中的影響受葉酸水平以及MTHFR TT基因型修飾的影響，與本研究類似。近期我國一項關于MTHFR基因型、葉酸干預Hhcy對卒中一級預防的修飾作用研究發表[19]，結果顯示在CC和CT基因型人群中，葉酸干預只有在高濃度Hcy情況下降低缺血性卒中風險(HR0.8，95%CI0.65～0.99)，而在TT基因人群中，葉酸干預在低濃度Hcy情況即可降低卒中風險(HR0.45，95%CI0.24～0.85)，該研究得出在中國人群中Hcy對卒中的風險受MTHFRC677位基因多態性以及補充葉酸修飾作用，也得出與本研究類似的結論。目前尚不清楚MTHFR基因多態性對干預Hhcy的卒中預防作用修飾的原因，考慮可能與TT基因型攜帶者可給予葉酸以及多種B族維生素后Hcy明顯下降有關。本研究非隨機對照研究，結論有一定的偏倚，需要進一步大規模的隨機對照研究進一步證實。

表2 三種基因型腦卒中不同治療復發率比較 (n)Table 2 Comparison of recurrence rates of different genotypes of stroke in different treatments (n)

表4 MTHFR677位TT型缺血性卒中復發危險因素的Logistic回歸分析Table 4 Logistic regression analysis of risk factors for recurrence of TT ischemic stroke in MTHFR677

本研究顯示，MTHFR基因對干預Hhcy腦卒中預防有有修飾作用，TT型基因攜帶者給予干預Hhcy對卒中復發的影響更明顯。MTHFRC677T基因突變率在不同人種中也不同，我國MTHFR677TT基因型約占25%，明顯高于歐美國家，提示根據MTHFR677基因型對我國合并Hhcy患者進行個體化治療指導可能更有意義。