siRNA干擾Gadd45α表達對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞侵襲和遷移的影響

李小靜 李志鋒 韓昭 燕霞 李顯平 劉保國 劉志軍056002河北邯鄲，河北工程大學附屬醫院皮膚科

皮膚鱗狀細胞癌（簡稱鱗癌）組織中生長抑制和DNA損傷誘導45蛋白α（growth arrest and DNA damage inducible 45α，Gadd45α）表達升高，且高分化組織中表達高于低分化癌組織，推測Gadd45α異常表達可能參與鱗癌發病過程［1］。為進一步探討Gadd45α在皮膚鱗癌中參與腫瘤侵襲轉移的作用，我們利用小RNA干擾技術下調皮膚鱗癌細胞株A431細胞Gadd45α基因表達，從而觀察Gadd45α對A431細胞侵襲和遷移等生物學行為的影響。

一、材料與方法

1.Trizol、G418產自美國Invitrogen公司，A431、Colon16細胞產自美國標準生物品收藏中心（ATCC），兔抗人Gadd45α多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產品，實時熒光定量PCR試劑盒產自美國Promega公司，CytoSelect 24孔細胞移行試驗試劑盒為美國Cell Biolabs公司產品，Transwell小室為美國Corning公司產品。

2.細胞培養及轉染：皮膚鱗癌細胞株A431細胞、Colon16細胞均采用含10%胎牛血清的Dulbecco極限必需培養基（Dulbecco′s minimum essential medium，DMEM），培養條件為37℃、5%CO2。選擇對數生長期細胞接種于24孔板，按照Lipofectamine2000脂質體轉染試劑盒說明書轉染操作。細胞轉染后繼續孵育48 h后接種于培養瓶。利用1 000 mg/L G418篩選2周。將篩選的細胞接種形成克隆，在尚未發生融合時，熒光顯微鏡下用刮刀挑取克隆，繼續培養于含G418（500 mg/L）的培養基中。

3.引物設計：在基因庫中查找Gadd45α基因序列，用Primer zpremier5.0軟件設計引物，使用核酸序列數據庫檢索程序排除其他的可能同源序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5′?GCGTCCAACAATGA GACCTACTG?3′，下游引物：5′?GGCAAAGCCCAAGACAACG GAGA?3′，目的產物302 bp。

4.siRNA序列設計：用美國Ambion公司和德國Qiagen公司的siRNA設計軟件設計4條siRNA序列（表1），由南京金斯特公司合成雙鏈siRNA編碼序列。將A431細胞隨機分為實驗組、陰性對照組和空白對照組：實驗組轉染Gadd45α?siRNA，陰性對照組轉染陰性對照siRNA，空白對照組不做任何處理。

5.實時熒光定量PCR檢測A431細胞、Colon16細胞及A431細胞轉染后Gadd45α mRNA的表達水平：應用Trizol試劑提取各細胞總RNA，測定總RNA質量和濃度，A260/A280比值在1.9～2.1之間為合格，各樣本取大致等量的總RNA，按說明書推薦條件將其反轉錄為cDNA，PCR擴增目的基因片段，反應條件為：95℃預變性2 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環30次，最后72℃再延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定凝膠紫外線成像儀下觀察、拍照，檢驗各電泳條帶的灰度值，計算Gadd45α與β肌動蛋白灰度比值。所有實驗均重復3次。

6.Western印跡檢測A431、Colon16細胞株及A431細胞轉染后Gadd45α蛋白表達：分別提取各細胞總蛋白，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞后，加入預冷的蛋白裂解液，收集上清液，提取細胞總蛋白，Brodford法測定蛋白含量。取70 μg蛋白上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS?PAGE）垂直電泳、聚亞乙烯雙氧化物（PVDF）轉膜，加入一抗（兔抗人Gadd45α抗體）、二抗（辣根過氧化物酶羊抗兔抗體，1∶5 000），X線曝光、顯影及定影，用各抗體灰度值與3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）灰度值的比值代表各目的蛋白的相對表達量。所有內參均使用β肌動蛋白。每組樣本各重復實驗3次。

7.Transwell實驗測定轉染對A431細胞侵襲能力的影響：先在每個Transwell小室的多聚碳酸酯膜上鋪人工基底膜膠（Matrigel），制成人工基底膜。分別取對數生長期細胞，胰蛋白酶消化后，以無血清培養基調整濃度為0.6×106/ml，將Transwell小室置入24孔板中，加入無血清培養基，室溫放置2 h，在小室外部加入含10%血清的培養基500 μl，棄去小室內部的無血清培養基，加入300μl細胞懸液，孵育48 h后，將小室置入含500 μl染液的培養孔中染色20 min，干燥后顯微鏡下計數高倍（×200）視野下穿過小室的細胞數。每組實驗重復3次。

8.細胞劃痕法測定轉染前后細胞的遷移能力：制備轉染前后A431單層細胞，用10 μl移液槍槍頭在單層細胞上呈“一”字劃痕，用PBS清洗3次，孵育24 h后換成含10%胎牛血清的DMEM細胞培養液孵育24 h，吸去培養液，用PBS清洗3次，高倍鏡下計數遷移到劃痕區的細胞數目。實驗重復3次。

9.統計學分析：采用SPSS13.0統計軟件進行分析。實驗數據用以±s表示，作方差齊性檢驗，采用方差分析統計數據，組間比較采用LSD?T檢測，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 針對Gadd45α基因的轉染序列

二、結果

1.Gadd45α在兩種皮膚鱗癌細胞株中的表達：Gadd45α基因在A431和Colon16細胞中均有表達，表達水平分別為0.985±0.017和0.480±0.016；Gadd45α蛋白在2株細胞中均有表達（圖1），表達水平分別為0.433±0.035和0.070±0.021。因此后續研究選取高表達Gadd45α基因和蛋白的A431細胞。

2.siRNA抑制Gadd45α mRNA的表達：實時PCR顯示，陰性對照組Gadd45α mRNA表達水平為1.028±0.183，空白對照組為1.001±0.057，實驗組siRNA?1干擾組表達水平為0.286± 0.013，siRNA?2干擾組為0.553±0.042，siRNA?3干擾組為0.484±0.027，siRNA?4干擾組為0.683± 0.015，siRNA?1干擾效果最好，故作為實驗組。統計學分析顯示，實驗組、陰性對照組、空白對照組間差異有統計學意義（F=5 893.857，P＜0.001），實驗組與陰性對照組和空白對照組間差異均有統計學意義（P=0.001）。

3.siRNA抑制Gadd45α蛋白的表達：Western印跡檢測顯示，實驗組條帶明顯變窄（0.33±0.007），與陰性對照組和空白對照組（0.87±0.002、0.86±0.004）比較，3組間差異有統計學意義（F=2 763.000，P＜0.001）；組間比較顯示，實驗組與陰性對照組和空白對照組間差異均有統計學意義（P=0.001）。見圖2。

4.A431細胞體外侵襲能力的變化：Transwell小室實驗顯示（圖3），培養48 h后，每高倍視野下遷移穿過聚碳酸酯膜的細胞數實驗組為66.33±3.79，陰性對照組為26.00±4.36，空白對照組為28.33±4.16，3組間差異有統計學意義（F=20.084，P=0.002）；組間兩兩比較顯示，實驗組與陰性對照組和空白對照組間差異均有統計學意義（P值分別為0.001、0.002）。

圖1 皮膚鱗癌細胞株A431和Colon16細胞Gadd45α蛋白表達

圖2 免疫印跡法檢測siRNA干擾后A431細胞Gadd45α蛋白表達

圖3 Transwell小室實驗及細胞劃痕實驗檢測siRNA干擾后A431細胞侵襲和遷移能力

5.細胞劃痕損傷實驗：單層細胞劃痕24 h后，實驗組細胞遷移數為315.33±6.66，陰性對照組154.67±2.08，空白對照組130.67±3.51，3組間差異有統計學意義（F=1676.255，P＜0.001）；組間比較顯示，實驗組與陰性對照組和空白對照組間差異均有統計學意義（P值為0.001）。見圖3。

三、討論

Gadd45在腫瘤細胞中參與多種細胞信號通路的調控，其表達缺失與腫瘤形成及進展密切相關。Gadd45α是Gadd45家族新近發現的一類細胞功能調節基因，參與多種惡性腫瘤細胞侵襲過程的調節［2］，該基因最早在紫外線照射和甲磺酸甲酯處理的倉鼠卵巢細胞中被發現，隨后研究認為，放射線、氧化應激、無血清饑餓等損傷因素會增加Gadd45α的表達［3］。Gadd45α基因在乳腺癌、非小細胞肺癌組織中的表達水平較正常組織中的表達均下調，并且在前列腺癌中也發現其表達被抑制［4?7］。Gadd45α基因在惡性涎腺腫瘤中低表達可能誘導腫瘤細胞的惡性增殖［8］。因此認為，Gadd45α是一個腫瘤抑制因子，在多種惡性腫瘤中呈低表達的趨勢，過表達該基因能夠抑制癌細胞的遷移與侵襲［9］。

為了明確Gadd45α基因表達異常是否通過影響鱗癌細胞的侵襲過程來參與皮膚鱗癌的惡性生物學行為，我們利用高表達Gadd45α的A431細胞株作為研究對象，通過轉染siRNA的方式來下調Gadd45α基因的表達，進而檢測細胞的侵襲和遷移能力。轉染Gadd45α siRNA后，A431細胞株中Gadd45α蛋白含量和mRNA含量均顯著降低，說明轉染siRNA能夠有效降低Gadd45α的表達。進一步采用Transwell小室和細胞遷移實驗檢測轉染A431細胞侵襲和遷移能力的變化。結果顯示，干擾Gadd45α表達后，A431細胞侵襲能力明顯增強。說明Gadd45α在皮膚鱗癌中可能起到抑制腫瘤侵襲的作用。

綜上，皮膚鱗癌A431細胞株高表達Gadd45α基因與蛋白水平，下調A431細胞Gadd45α表達能夠促進癌細胞侵襲與遷移，但Gadd45α對皮膚鱗癌的抑制作用機制尚需進一步研究。

［1］李小靜,王震英,劉毅,等.p53、Gadd45α蛋白在皮膚鱗狀細胞癌、基底細胞癌中的表達［J］.中國麻風皮膚病雜志,2011,27（7）:455?457.doi:10.3969/j.issn.1009?1157.2011.07.003.

［2］Zhang L,Yang Z,Liu Y.GADD45 proteins:roles in cellular senescence and tumor development［J］.Exp Biol Med（Maywood）,2014,239（7）:773?778.doi:10.1177/1535370214531879.

［3］Moskalev A,Plyusnina E,Shaposhnikov M,et al.The role of D?GADD45 in oxidative,thermal and genotoxic stress resistance［J］.Cell Cycle,2012,11（22）:4222?4241.doi:10.4161/cc.22545.

［4］Tront JS,Willis A,Huang Y,et al.Gadd45a levels in human breast cancer are hormone receptor dependent［J］.J Transl Med,2013,11:131.doi:10.1186/1479?5876?11?131.

［5］Higashi H,Vallb?hmer D,Warnecke?Eberz U,et al.Down ?regulation of Gadd45 expression is associated with tumor differen?tiation in non?small cell lung cancer［J］.Anticancer Res,2006,26（3A）:2143?2147.

［6］Gao QZ,Fei BJ,Qi XW,et al.Significance and expression of p53,p21（Cip1/WAF1）and Gadd45α in breast neoplasm tissues［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2012,92（34）:2389?2393.

［7］Tamura RE,Paccez JD,Duncan KC,et al.GADD45α and γ interaction with CDK11p58 regulates SPDEF protein stability and SPDEF?mediated effects on cancer cell migration［J］.Oncotarget,2016,7（12）:13865?13879.doi:10.18632/oncotarget.7355.

［8］郭淑榮,董剛,李濤,等.生長抑制和DNA損傷基因45α在人不同組織類型涎腺腫瘤中的表達［J］.醫學分子生物學雜志,2015,（1）:7?11.doi:10.3870/j.issn.1672?8009.2015.01.002.

［9］Tamura RE,de Vasconcellos JF,Sarkar D,et al.GADD45 proteins:central players in tumorigenesis［J］.Curr Mol Med,2012,12（5）:634?651.