Dectin?1介導人急性單核細胞白血病細胞巨噬細胞樣細胞吞噬白念珠菌的作用研究

段志敏 杜蕾蕾 劉彩霞 曾榮 沈永年 胡素泉 劉維達 陳青 李岷

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所 江蘇省皮膚性病分子生物學重點實驗室（段志敏、李岷），中心實驗室（杜蕾蕾），激光科（曾榮），真菌科（沈永年、胡素泉、劉維達）；南京醫科大學附屬南京市第一醫院皮膚科（劉彩霞）；江蘇省血液中心（陳青）

樹突細胞相關C型凝集素1（Dectin?1）是一種重要的C型凝集素樣受體，能夠特異性識別β葡聚糖的模式識別受體（PRR），可在結合β葡聚糖后激活并誘導機體產生固有免疫反應和適應性免疫反應，包括介導吞噬、活化信號傳導通路和轉錄因子，產生活性氧以及分泌細胞因子和趨化因子等［1?2］。已有研究證實，Dectin?1可介導白念珠菌與巨噬細胞的識別，進而導致機體抗白念珠菌的免疫反應［3］。人單核細胞白血病細胞（THP?1）來源于人原始單核細胞，常用來研究單核-巨噬細胞的功能、信號傳導通路、代謝情況及吞噬活性等［4］，用丙二醇甲醚醋酸酯（propylene glycol monomethyl ether acetate，PMA）可誘導分化為成熟巨噬細胞［5］。本研究觀察巨噬細胞吞噬白念珠菌情況，探討Dectin?1受體對巨噬細胞吞噬白念珠菌的影響。

資料和方法

一、資料

1.細胞和菌株：THP?1購于美國模式培養物集存庫（ATCC）。白念珠菌由中國微生物菌種保藏管理委員會醫學真菌中心、中國醫學科學院皮膚病研究所真菌科提供。

2.主要試劑：鈣熒光白染料（CFW，美國Sigma?Aldrich公司）；二氫羅丹明（DHR123，德國Ruibio公司）；iTaq Universal SYBR Green Supermix（美國Bio?rad公司）；PrimeScript RT Master Mix反轉錄酶試劑盒（日本Takara公司）；抗人/靈長類Dectin?1 PE抗體（美國eBioscience公司）。

二、方法

1.細胞培養與siRNA轉染：細胞制備成105/ml細胞懸液，接種于6孔（每孔2 ml）及12孔（每孔1 ml）細胞培養板，加入100 μg/L PMA刺激48 h后換液。針對Dectin?1基因，設計并合成特異性siRNA（上海吉瑪制藥技術有限公司，編號為CLEC7A?Homo?335）序列。正向引物：5′?GGGAAUCCUAUGCUUGG UATT?3′，反向引物5′?UACCAAGCAUAGGAUUCCC TT?3′。無義片段（NC）序列，正向引物：5′?UUCUCC GAACGUGUCACGUTT?3′，反向引物：5′?ACGUGAC ACGUUCGGAGAATT?3′。以 lipofectamine 2000 為載體轉染入THP?1巨噬細胞樣細胞。

2.菌株制備與染色：以血球計數板計數，最終配制成108CFU/ml菌懸液，置于水浴鍋內56℃30 min滅活。滅活白念珠菌菌懸液以0.1 mg/ml CFW室溫染色30 min，PBS洗滌，熒光顯微鏡下觀察。CFW可與真菌細胞壁多糖成分結合，染色后真菌輪廓在紫外線下呈藍色。白念珠菌孢子與DHR123（30μmol/L）于37℃孵育30 min，離心，PBS洗滌后熱滅活，用于流式細胞儀檢測吞噬率。CFW及DHR123為常用微生物染色劑，不影響微生物吞噬過程［6?7］。

3.實時熒光定量PCR法檢測Dectin?1 mRNA表達：將轉染siRNA 24 h的THP?1巨噬細胞樣細胞以TRIzol法提取總RNA，按Prime Script RT Master Mix反轉錄酶試劑盒說明書將1 μg總RNA反轉錄為cDNA。使用ABI7300 PCR儀，采用SYBR Green法擴增目的基因。β肌動蛋白和Dectin?1引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。β肌動蛋白引物序列，正向5′?TCTGGCA CCACACCTTCTA?3′，反向5′?AGGCATACAGGGACA GCAC?3；Dectin?1引物序列，正向 5′?GGAAGCAAC ACATTGGAGAATGG?3，反向 5′?CTTTGGTAGGAGTC ACACTGTC?3′。反應條件：預變性95℃10 min，變性95℃15 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，循環數40。以β肌動蛋白為內參照，得到基因Ct值，結果按2?ΔΔCt計算，得到Dectin?1與β肌動蛋白基因相對量。實驗重復3次。

4.流式細胞儀檢測Dectin?1蛋白表達：轉染siRNA 24 h THP?1巨噬細胞樣細胞重懸于100 μl PBS中，每孔加入5 μl Dectin?1 PE流式抗體，4 ℃孵育30 min；以PBS洗滌2次，振蕩混勻，懸浮在200 μl PBS中，流式細胞儀檢測，每份樣品收集10 000個細胞，通過FSC/SSC設門。采用Flow Jo軟件進行分析，統計門內細胞平均熒光強度（MFI）。

5.siRNA干擾Dectin?1后THP?1巨噬細胞樣細胞對白念珠菌吞噬檢測：轉染siRNA的THP?1巨噬細胞樣細胞與CFW染色的白念珠菌以1∶10比例共培養1、2、4 h。用PBS洗2遍，熒光顯微鏡下觀察、拍照。分別選擇×40倍10個視野，計算吞噬率，吞噬率=吞噬白念珠菌的細胞數/總細胞數×100%；吞噬≥3個白念珠菌的細胞百分比=吞噬≥3個白念珠菌的細胞數/總細胞數×100%。將轉染siRNA的THP?1巨噬細胞樣細胞與DHR123標記白念珠菌以1∶10共培養30 min、1 h、2 h、4 h，用PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測吞噬情況。

6.統計學分析：應用SPSS19.0統計軟件，計量資料以±s表示。不同處理間mRNA表達水平比較采用單因素方差分析，并采用LSD?t檢驗進行兩兩比較。采用FlowJo7.6.2軟件分析細胞表面Dectin?1的MFI及吞噬后DHR123的MFI，以±s表示，用t檢驗進行統計分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、THP?1巨噬細胞樣細胞轉染siRNA?Dectin?1后Dectin?1 mRNA及蛋白表達

轉染siRNA?Dectin?1后Dectin?1 mRNA相對表達量為0.26±0.02，和轉染NC相比（1.0±0.02）差異有統計學意義（t=26.163，P＜0.001）。轉染NC與siRNA?Dectin?1后，Dectin?1蛋白表達量（MFI）分別為38.44±0.43、20.34±0.34，差異有統計學意義（t=33.03，P＜0.001）。

表1 siRNA干擾Dectin?1對THP?1巨噬細胞樣細胞吞噬白念珠菌的影響（±s）

表1 siRNA干擾Dectin?1對THP?1巨噬細胞樣細胞吞噬白念珠菌的影響（±s）

注：n=3

組別 吞噬率（%）無義片段組siRNA?Dectin?1組t值P值刺激后1 h 22.1±0.2 17.5±0.1 23.95＜0.05刺激后2 h 24.3±0.2 18.6±0.2 20.66＜0.01刺激后4 h 59.1±0.3 39.2±0.2 54.08＜0.01吞噬≥3個菌的細胞百分比（%）刺激后1 h 4.7±0.1 2.2±0.1 15.01＜0.01刺激后2 h 5.4±0.2 2.5±0.1 17.30＜0.01刺激后4 h 8.3±0.4 5.1±0.2 24.40＜0.01

二、熒光顯微鏡下觀察siRNA干擾Dectin?1對THP?1巨噬細胞樣細胞吞噬白念珠菌的影響

THP?1巨噬細胞樣細胞轉染siRNA后與滅活白念珠菌共培養1、2、4 h后，吞噬率、吞噬≥3個菌細胞百分比明顯降低（表1）。以預先用CFW染色后白念珠菌與THP?1巨噬細胞樣細胞共培養，可見巨噬細胞將白念珠菌吞入胞內（圖1）。

三、流式細胞儀檢測siRNA干擾Dectin?1對THP?1巨噬細胞樣細胞吞噬白念珠菌的影響

圖1 熒光顯微鏡下無義片段組與白念珠菌培養2 h（×100） 可見白念珠菌（藍色熒光）被THP?1巨噬細胞樣細胞吞入胞內

圖2 DHR123染色前后流式細胞儀檢測白念珠菌孢子的熒光強度變化

表2 轉染siRNA?Dectin?1后THP?1巨噬細胞樣細胞吞噬白念珠菌的平均熒光強度（MFI）（±s）

表2 轉染siRNA?Dectin?1后THP?1巨噬細胞樣細胞吞噬白念珠菌的平均熒光強度（MFI）（±s）

注：n=3

組別無義片段組siRNA?Dectin?1組t值P值刺激后30 min 45.7±0.35 36.8±0.19 22.348＜0.05刺激后1 h 62.4±0.42 54.3±0.23 16.915＜0.05刺激后2 h 84.9±0.39 72.1±0.29 24.836＜0.05刺激后4 h 116.7±0.67 93.6±0.55 26.649＜0.05

DHR123染色白念珠菌后，90%孢子熒光陽性（圖2）。轉染siRNA?Dectin?1后THP?1巨噬細胞樣細胞吞噬白念珠菌每組平均熒光強度與轉染NC相比降低，P＜ 0.05（表2）。

討 論

吞噬作用屬于一種保守的固有免疫反應，對于病原微生物的殺傷、清除以及啟動適應性免疫反應都具有重要作用。吞噬作用依賴于細胞表面吞噬相關受體，如Dectin?1受體、甘露糖受體（MR）、清道夫受體等；受體與配體結合并活化，介導吞噬反應。

機體對白念珠菌吞噬作用構成了抗白念珠菌感染第一道防線，目前已報道多種受體參與介導對白念珠菌的吞噬，如Dectin?1、MR、補體受體等［1］。Dectin?1受體作為一種重要的與β葡聚糖高親和力結合的PRR，在抗白念珠菌感染方面作用突出，研究廣泛。然而，既往研究多以單獨白念珠菌細胞壁成分進行研究，不能準確反映出白念珠菌孢子刺激機體后出現的吞噬效應。本研究通過siRNA干擾Dectin?1受體表達，以熒光顯微鏡和流式細胞儀兩種方法檢測巨噬細胞在干擾Dectin?1受體表達前后對白念珠菌吞噬效應，從整體角度闡述Dectin?1受體在白念珠菌感染后的吞噬效應中所發揮的作用。

Dectin?1與β葡聚糖結合后，刺激信號通過Dectin?1的跨膜桿狀結構使細胞質側的ITAM磷酸化，再通過活化Dectin?1-脾臟酪氨酸激酶（Syk）-胱冬肽酶募集結構域9（CARD9）信號傳導途徑、絲氨酸-蘇氨酸激酶-1（Raf?1）信號傳導途徑來誘導免疫反應［3?5］，產生一系列細胞因子、趨化因子［8］。同時作為一種吞噬受體，Dectin?1能介導巨噬細胞識別和吞噬酵母相的白念珠菌［4］。已有研究發現，阻斷對β葡聚糖的吞噬作用會引起增強且持久的炎癥反應，提示Dectin?1受體所介導的吞噬作用不僅在清除外來病原體方面起作用，而且可以調控β葡聚糖引起的下游炎癥反應［8］。在本研究中，通過為THP?1巨噬細胞樣細胞轉染Dectin?1受體siRNA，經mRNA與蛋白水平驗證，Dectin?1受體表達水平明顯降低，證明轉染成功。在干擾了Dectin?1受體表達后發現其對白念珠菌吞噬水平較轉染無義片段組明顯降低，提示Dectin?1受體在巨噬細胞吞噬白念珠菌的效應中發揮重要作用，降低Dectin?1水平的表達將減少對白念珠菌清除。

本研究結果顯示，在明顯降低Dectin?1受體表達水平后，巨噬細胞對白念珠菌仍有一定水平吞噬效應，且隨著時間延長，吞噬效應逐漸增加，提示在減少或缺乏Dectin?1受體表達情況下，其他受體仍然可以介導對白念珠菌吞噬效應。已報道β葡聚糖可以直接活化補體旁路途徑介導吞噬效應［9?10］；白念珠菌細胞壁的甘露聚糖成分可與MR結合并誘導激活發揮吞噬功能［11?12］，因此，巨噬細胞對白念珠菌吞噬作用與多個受體聯合作用相關。通過提高Dectin?1活化水平，可能會提高對白念珠菌感染控制水平；從而為臨床上抗白念珠菌感染提供新的防治思路。

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