離體灌注新型去垢劑用于組織工程人工肺構建實驗

馬金輝，于 潔，喬葉薷，侯陳瑋，陳書弘，黑飛龍

急性、慢性肺損傷均可能導致終末期肺病。對終末期肺病患者來說,肺移植是唯一有效的治療方式。然而,由于供體缺乏,僅有不到20%的患者有機會進行肺移植手術,而且需要長期服用免疫抑制劑,10年的死亡率超過60%［1］。組織工程人工肺基于脫細胞肺支架,種植宿主自體細胞,在未來有望提供一種理想的供體來源［2］。灌注去垢劑法制備脫細胞肺支架,已經被證明可以有效的去除肺內細胞,同時最大程度的保留細胞外基質(extracellular matrix,ECM)蛋白［3］。灌注途徑主要有經主肺動脈和經主支氣管兩種［4］,目前,經支氣管途徑受到越來越多的關注。本研究經支氣管途徑灌注一種新型去垢劑制備脫細胞支架,有望提供一種簡便、有效的脫細胞方法。同時制備一種簡易的生物反應器來種植種子細胞,為細胞的有效種植奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 動物與設備 清潔級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠18只,200～220 g,購于阜外醫院實驗動物中心,實驗通過醫院動物倫理會批準。Langendorff灌流系統(北京眾實迪創科技發展有限責任公司),蠕動泵(kamoer),組織勻漿儀(Roche),冷凍干燥機(Labconco),光學顯微鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica),全自動細胞計數儀(賽默飛),HL-2恒流泵(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 主要試劑 十二烷基醚硫酸鈉(sodium lauryl ether sulfate,SLES)(河北萬冶化工股份有限公司),肺泡II型上皮細胞(A549細胞,ATCC),6-二脒基-2-苯基吲哚(4＇,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)及F12K培養基(Sigma),DNA提取試劑盒(Qiagen),DAPI封片劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 取材與分組 18只SD大鼠,腹腔內注射3%戊巴比妥鈉溶液(150 mg/kg),麻醉滿意后快速打開胸腔,心、肺、支氣管整體切除。……