長鏈非編碼RNA H19在非小細胞肺癌患者血清中的表達及臨床意義

譚 楠，劉婷婷，趙 昆

西安市第一醫院(西安710002)

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的RNA，雖然lncRNA不編碼蛋白，但可以在轉錄以及轉錄后水平上調控基因表達[1]。研究發現lncRNA在細胞增殖、凋亡及分化過程中發揮重要作用，參與了多種腫瘤的發生、發展、轉移等病理過程，并與治療效果及預后有關[2-5]。無論是我國還是全球肺癌的年發病人數及年死亡人數均居腫瘤首位[6]，迄今為止肺癌的發病機制尚未完全清楚，研究提示肺癌發病與吸煙、肺部慢性感染、空氣污染及職業等因素有關。lncRNA H19是2006年Gabory等人發現的一種長鏈非編碼RNA[7]，國內外學者研究發現lncRNA H19在多種腫瘤組織中異常表達，參與了腫瘤的病理過程并與治療及預后有關[8-13]，研究證實lncRNA H19在肺癌組織及肺癌細胞系A549中高表達[14-15]。為了進一步研究lncRNA H19在非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)中的作用，本研究檢測了68例NSCLC患者血清中lncRNA H19的表達水平，并初步分析lncRNA H19水平與病理指標之間關系。

資料與方法

1 一般資料 隨機選擇我院2016年1月至2017年3月期間68例住院NSCLC患者，所有患者均經過病理確診。其中男性41例，女性27例，年齡35～78歲，平均年齡(58.32±11.47)歲；鱗癌24例、腺癌41例、大細胞癌3例；根據2009年國際抗癌聯盟(UICC) (第7版)肺癌標準進行TNM分期，其中Ⅰ期 16例，Ⅱ期 21例，Ⅲ期 29例，Ⅳ期2例。對照組為68例同期健康體檢者，男性42例，女性26例；年齡33～76歲，平均年齡(54.73±12.08)歲。本研究得到了所有研究對象的同意并經過醫院倫理委員會的審核批準。

2 主要試劑 miRNeasy Serum/Plasma Kit為德國QIAGEN公司產品，PrimeScript RTTMreagent Kit (Perfect Real Time)、SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)購自寶生物工程(大連)有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3 實驗方法 ①樣本采集：無菌抽取所有研究對象空腹靜脈血3.0 ml，室溫放置30 min后，2000 r/min 離心10 min，吸取上層液體至EP管中，4℃ 12000 r/min離心10 min后吸取上清至新的EP管中，-80℃保存。②血清中總RNA提取：取100 μl血清加入500 μl的QIAzol Lysis Reagent震蕩混勻，室溫放置5 min；加入等量的氯仿劇烈震蕩15 s，室溫放置2～3 min；4℃，12000 r/min，離心15 min后將上層水相轉移至新的EP管中，加入1.5倍體積的無水乙醇，吹打混勻；吸取700 μl混合液，轉移到一個2 ml的Rnase min洗脫柱中，室溫10000 r/min離心15 s，棄廢液；分別加入700 μl 緩沖液RWT、500 μl緩沖液RPE、500 μl 80%乙醇到Rnase min洗脫柱中室溫分別10000 r/min 離心15 s，棄廢液；將RNase洗脫柱放入一個新的2 ml收集管中12000 r/min離心5 min，將Rnase min洗脫柱放置在一個新的1.5 ml的收集管中，加入14 μl RNase-free水到洗脫柱膜的中心位置，12000 r/min離心1 min。③逆轉錄反應：分別加入5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2 μl、RNA 2 μl、無RNA酶的水6 μl，操作在冰上進行，反應條件：37℃ 15 min、85℃ 5 s，反應結束后4℃保存。④定量PCR擴增：根據文獻[16]合成H19及內參β-actin的引物，分別加入SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μl、上下游引物各0.4 μl、ROX Reference Dye 0.4 μl、DNA模板2 μl、滅菌水6.8 μl，操作在冰上進行。反應條件：95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s共40個循環。PCR擴增結束后可以得到Ct值，H19表達水平采用 2-△△Ct法進行計算。

結 果

1 NSCLC患者血清中lncRNA H19的表達水平 lncRNA H19在NSCLC患者血清中的表達水平為(2.32±0.94)，與正常對照組(1.24±0.58)相比明顯增高，兩組之間的差異具有統計學意義(t=8.063，P<0.01)。

2 血清中lncRNA H19表達水平與NSCLC病理指標間的關系 見表1。統計分析血清中lncRNA H19的水平與NSCLC臨床病理指標間的關系結果發現，NSCLC患者血清中lncRNA H19水平在不同年齡、性別、病理類型、腫瘤大小及腫瘤分化程度之間的差異無統計學意義(P>0.05)。淋巴轉移陽性的NSCLC患者血清中lncRNA H19水平明顯高于淋巴轉移陰性的NSCLC患者，差異具有統計學意義(P<0.05)；與Ⅰ+Ⅱ期NSCLC患者相比，Ⅲ+Ⅳ期NSCLC患者血清中lncRNA H19水平明顯增高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 血清中H19水平與NSCLC病理指標之間的關系

討 論

肺癌是嚴重危險人民身體健康的常見惡性腫瘤之一，病死率居各種腫瘤的第一位。由于肺癌的早期臨床表現不明顯，甚至部分患者早期無任何癥狀，出現癥狀就醫時多數患者已經處于中晚期，因此早期發現肺癌比較困難[6，17]。而肺癌的治療效果、預后與TMN分期密切相關，肺癌的早期發現對提高患者的5年生存率尤為重要。

lncRNA起初被認為不具有生物學功能，但隨著高通量RNA測序、生物芯片、RNAi、RIP等生物分子技術和生物信息學的發展，研究證實lncRNA具有復雜的生物學功能，參與了多種生理過程，lncRNA表達異常可以導致疾病的發生[1-2]。研究發現MALAT1、HOTAIR、CAR10、RGMBAS1、ANRIL等多種lncRNA在NSCLC中表達增高，而GAS5、MEG3、TUG1等lncRNA表達降低[18-19]，研究還發現HOTTIP、CCAT2、HOTAIR、MALATI、ANRIL、CASC8的基因多態性與肺癌發病及鉑類化療反應性有關[18]。H19基因長度為2.3kb，定位于小鼠7號染色體，人11p15[7]。國內外學者研究發現lncRNA H19在腎細胞癌[8]、胃癌[9]、乳腺癌[10]、結直腸癌[11]、卵巢癌[12]、膠質母細胞瘤[13]等多種腫瘤組織中異常表達，與腫瘤的發生發展、治療效果及預后密切相關。Zhou等人[14]逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測發現與癌旁組織相比，NSCLC組織中lncRNA H19和miR-21表達水平增高，且與腫瘤分期及淋巴轉移、腫瘤大小有關。有學者研究發現lncRNA H19可以促進非小細胞肺癌細胞A549增殖、侵襲及發生上皮-間質轉化[15]。

lncRNA的穩定性比較高，在血清、血漿或尿液等體液中可以穩定存在，在乳腺癌[16]、宮頸癌[20]、胃癌[21]、原發性肝癌[22]外周血清或血漿中表達水平升高，且與腫瘤的分化程度、化療敏感性及預后有關，有可能成為臨床診斷的標志物。為了進一步研究lncRNA H19在NSCLC中的作用，本研究采用實時定量PCR檢測NSCLC患者血清中lncRNA H19表達水平，結果發現lncRNA H19在NSCLC患者血清表達水平明顯增高，這與lncRNA H19在腫瘤組織中的研究結果一致[14-15]，提示lncRNA H19在NSCLC病理過程中發揮了作用。研究還發現血清中lncRNA H19的表達水平與患者的年齡、性別、病理類型、腫瘤大小及分化程度無關，而與淋巴結轉移及TMN分期有關，lncRNA H19可能參與了腫瘤的侵襲及轉移過程。而Zhou等人[14]研究發現NSCLC組織中lncRNA H19水平與腫瘤大小有關，這可能與樣本選擇有關，有待于進一步擴大樣本量進行深入研究。

綜上所述，NSCLC患者血清中lncRNA H19表達水平明顯增高，且與淋巴結轉移及TMN分期有關，提示lncRNA H19參與了NSCLC發生發展過程，深入研究lncRNA H19在NSCLC中的作用，有可能為NSCLC的早期診斷及治療提供新的靶點。

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