BK通道在重度燒傷大鼠冠狀動脈的表達及意義*

侯宏義,袁 宗,蔡維霞,謝松濤,胡大海

空軍軍醫大學西京醫院燒傷與皮膚外科(西安710032)

心肌細胞損害是嚴重燒傷早期引起心功能不全的主要原因，而缺血缺氧是嚴重燒傷早期心肌損害的主要致病因素[1]。大電導電壓和鈣依賴性鉀通道(Large-conductance voltage- and Ca2+-activated K+channels, maxi-K channel, BK channel)廣泛分布于平滑肌細胞，對細胞的舒縮具有調節作用[2]。BK通道的基本組成包括由α和β亞基組成，對BK通道的功能具有調節作用[3]。研究表明，BK通道參與調控缺血再灌注后的細胞保護作用[4]。為探討BK通道是否參與大面積重度燒傷后心肌損傷和保護，本文擬采用RT-PCR和Western blot方法對BK通道的α亞基在冠狀動脈的表達變化進行檢測，并通過α亞基激動劑(NS1619)對BK通道的干預，進一步觀察BK通道對心肌細胞的保護作用。

材料與方法

1 主要試劑與儀器 BK通道 α亞基抗兔一抗、NS1619購自Alomone Labs公司；β-actin一抗購自美國Sigma公司；HRP標記山羊抗兔IgG二抗、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、ELISA檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；組織細胞裂解液購自北京賽馳生物科技有限公司；RNAiso Plus試劑、反轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司。定量PCR儀IQ5系統(美國Bio-Rad公司)；Alphalmager TM2200凝膠圖像分析系統(美國安萊公司)。RNA提取及轉錄試劑盒(大連寶生物工程公司)。

2 動物模型及分組 SD雄性大鼠，18只，體重200～250 g[空軍軍醫大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(軍2005-009)]。隨機分為假傷組(sham組)、燒傷組(burn組)、藥物組(NS1619組)，每組6只。采用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg)后，燒傷組及藥物組背部剃毛、脫毛后置95℃熱水中18 s,造成30%TBSA的Ⅲ度燙傷模型，按照每1%TBSA,2 ml/kg，腹腔補液(燒傷組0.9%氯化鈉注射液，藥物組濃度為5 mmol/kg的NS1619)1次/8 h。假傷組置于25℃水18 s，模擬燒傷處理，按10 ml/kg腹腔補液(0.9%氯化鈉注射液), 1次/8 h，其余處理三組均相同。

3 標本采集 燒傷后12 h，采用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg)后，抽取腹主動脈血10 ml，室溫靜置30 min，4℃，1500 g，離心15 min，收集上清置于-80℃凍存。開胸暴露心臟，分別分離出前降支、右側和間隔支的冠狀動脈氮速凍后，收集于-80℃冰箱凍存待用。

4 心肌酶譜檢測 取各組凍存血清，室溫放置1 h融化，按操作說明書采用ELISA法測定血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)含量。

5 實時定量RT-PCR檢測 按照試劑盒說明書提取冠狀動脈總RNA，計算RNA濃度；反轉錄合成cDNA并進擴增。引物序列見表1，PCR 反應條件采用兩步法，擴增條件：預變性變性95 ℃,30s；變性95 ℃，5 s；退火60℃, 30 s；40個循環。使用Bio-Rad的IQ5系統進行Sybr Gree的熒光定量PCR分析。結果按照IQ5分析軟件采用比較CT法相對定量，以actin為內參對照。

表1 實時熒光定量引物序列

6 Western blotting檢測 取凍存的冠狀動脈30 mg，加組織細胞裂解液300 μl勻漿，分離上清，提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，10%聚丙烯酰胺SDS-PAGE電泳，濕轉方法轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。4℃過夜孵育BK通道 α亞基抗兔一抗(1∶300)，β-actin (1∶10000)作為對照。洗膜后室溫孵育抗兔IgG二抗(1∶5000)2 h。洗膜后ECL試劑盒化學發光、顯影，Alphalmager TM2200凝膠圖像分析系統進行灰度掃描，計算目標蛋白相對量表達水平。

結 果

1 血清心肌酶變化 見表2。心肌細胞受損后，心肌酶釋放入血，外周血心肌酶的變化反映了心肌的受損程度。心肌酶測定結果顯示：燒傷組的乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)均明顯增高，表明心肌細胞損害嚴重，藥物組的LDH和CK值均明顯低于燒傷組(P<0.01)。

表2 三組大鼠心肌乳酸脫氫酶和肌酸激酶的變化(U/L)

注：與sham組比較，*P<0.01；與burn組比較，△P<0.01

2 冠狀動脈BK通道α亞單位mRNA及蛋白表達變化 見表3、圖1。實時熒光定量PCR和Western blotting 的檢測結果顯示燒傷后12 h，冠狀動脈BK通道α亞基的mRNA及蛋白表達水平均明顯降低(P<0.01),而藥物組的表達卻明顯高于燒傷組(P<0.05)。

表3 三組大鼠冠狀動脈BK通道α亞單位 mRNA和蛋白的表達

注：與sham組比較，*P<0.01；與burn組比較，△P<0.01

圖1 Western blotting檢測三組大鼠冠狀動脈 BK通道α亞單位蛋白的表達

討 論

嚴重燒傷早期存在心肌細胞的損害和心功能不全，形成“休克心”，心肌細胞損害的原因是多方面的，研究表明冠狀動脈的血供減少是心肌細胞缺血缺氧損傷的重要原因[5]，心肌損傷大鼠早期主要是心臟的舒張功能降低，而無心臟結構的變化[6]。平滑肌細胞在調節冠狀動脈的血管舒縮狀態起到主要作用。因此，研究燒傷后冠狀動脈平滑肌細胞的調控通道，對燒傷后心肌胞的保護作用具有重要意義。其中由此給抗休克復蘇治療帶來很大的困難，并進一步加重機體組織器官的缺血、缺氧。如何保護心肌細胞及增強心功能是嚴重燒傷成功救治的關鍵。研究表明大面積燒傷后血容量的減少與心功能的降低并不成比例[7]。燒傷后心功能的改變主要表現為心肌酶譜的改變、心臟肌力的變化及心輸出量的降低等，本文通過30% TBSA Ⅲ度燒傷大鼠模型，通過檢測冠狀動脈BK通道和心肌酶譜，初步探討BK通道在燒傷后心肌細胞損傷中的作用機制。

BK通道為電壓依賴性鉀離子通道家族成員之一，廣泛分布于血管平滑肌細胞的膜性結構,調節血管的收縮和舒張[2]。鈣通道和鉀通道的動態平衡是維持血管平滑肌舒縮活動的關鍵，平滑肌細胞的活動依賴細胞內鈣離子濃度的高低，鈣離子濃度的多少與鉀離子通道及鈣離子通道的表達和功能息息相關[8-9]。通過熒光定量RT-PCR和蛋白質免疫印跡技術對大面積燒傷大鼠心臟冠脈BK通道的檢測,結果顯示BK通道α亞基mRNA及蛋白水平均降低。研究表明α亞基的表達降低使平滑肌細胞外向鉀電流減少，動作電位復極化時間延長，鈣離子內流增多，細胞內高濃度的鈣離子使平滑肌細胞收縮增強,引起血管收縮[2]，因此我們認為，燒傷后，BK通道α亞基的降低可能介導了冠狀動脈的收縮,進而引起了心肌細胞的損害。NS1619為BK通道激動劑，我們采用腹腔注射的方式給藥，發現NS1619能夠使燒傷大鼠BK通道α亞基表達增高，血清乳酸脫氫酶和肌酸激酶降低，進一步說明BK通道在燒傷后的心肌細胞損傷保護中具有重要作用。之前在心肌缺血模型發現心肌冠脈BK通道參與心肌缺血早期的心肌保護[10]，我們的結果與此一致。

本文以大面積燒傷大鼠模型為研究對象，通過觀察BK通道在大面積燒傷早期心肌冠脈的表達變化，研究心肌細胞的損傷保護作用,為大面積燒傷后心臟功能不全的機制研究提供了新的依據。

[1] Papp A, Uusaro A, Parviainen I,etal. Myocardial function and haemodynamics in extensive burn trauma: evaluation by clinical signs, invasive monitoring, echocardiography and cytokine concentrations. A prospective clinical study[J]. Acta Anaesthesiologica Scandinavica,2003, 47(10)：1257-1263.

[2] Orres YP, Granados ST,Latorre R. Pharmacological consequences of the coexpression of BK channel alpha and auxiliary beta subunits[J]. Frontiers in Physiology,2014,5：383.

[3] Singh H, Lu R, Bopassa JC,etal. MitoBK(Ca) is encoded by the Kcnma1 gene, and a splicing sequence defines its mitochondrial location[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2013, 110(26)：10836-10841.

[4] Tano JY,Gollasch M. Hypoxia and ischemia-reperfusion: a BiK contribution?[J]. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology,2014, 307(6)：H811-817.

[5] Guillory AN, Clayton RP, Herndon DN,etal.Cardiovascular dysfunction following burn injury: what we have learned from rat and mouse models[J]. International Journal of Molecular Sciences,2016, 17(1)：E53.

[6] 邵 靚,張 萍,張 勇,等.急性心肌缺血再灌注大鼠早期心臟舒張功能降低及心肌纖維化的研究[J].陜西醫學雜志,2014,43(5)：518-521.

[7] Huang Y,Zheng J.Transfection of antisense p38 alpha gene ameliorates myocardial cell injury mediated by hypoxia and burn serum[J].Burns：Journal of the International Society for Burn Injuries, 2007,33(5)：599-605.

[8] Ledoux J, Werner ME, Brayden JE,etal. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone[J]. Physiology (Bethesda, Md.),2006,21：69-78.

[9] 李淑巖,崔麗杰,王麗杰,等.急性心肌梗死心肌組織再灌注的心電圖ST段動態變化分析[J].陜西醫學雜志,2017,46(1)：51-52.

[10] Han JG, Yang Q,Yao XQ,etal. Role of large-conductance calcium-activated potassium channels of coronary arteries in heart preservation[J]. The Journal of heart and lung transplantation：the Official Publication of the International Society for Heart Transplantation,2009, 28(10)：1094-1101.