川芎嗪對人肝癌HepG-2細胞體外侵襲和遷移的影響

孫曉，尹中普，尹紅梅

肝癌是一種具有高侵襲和高轉移性的惡性腫瘤，患者手術后腫瘤復發率高，預后差[1]。研究表明[2]，惡性腫瘤轉移和侵襲是導致腫瘤患者術后復發及疾病惡化的主要因素，但其發生機制較為復雜，目前尚未完全明確，阻斷腫瘤細胞的侵襲和轉移也是目前臨床抗腫瘤治療的重要方法。作為“血中氣藥”的川芎主要用于瘀血阻滯類疾病的治療，其有效成分川芎嗪（TMP）具有多種生物學特性，在消化、呼吸、泌尿和心血管系統疾病的治療中被廣泛應用[3，4]。體外研究表明，TMP可誘導多種腫瘤細胞的凋亡，具有良好的抗腫瘤活性[5]。本研究旨在探討TMP對人肝癌HepG-2細胞體外侵襲和轉移的影響，初步分析了其作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人肝癌HepG-2細胞購自中科院上海細胞庫。TMP由中國藥品生物制品檢定所提供，多聚甲醛（Sigma公司），DMEM培養基和胰蛋白酶（Gibco公司），胎牛血清（FBS，BioSHARP公司），Transwell小室（Millipore公司），兔抗基質金屬蛋白酶-2（MMP-2，Santacruz公司），兔抗基質金屬蛋白酶組織抑制因子-2（TIMP-2，北京中杉金橋生物技術有限公司），羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶（HRP，Bioworld公司）。

1.2 TMP對HepG-2細胞粘附的影響 取對數生長期的HepG-2細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后接種于6孔板，106個/孔。實驗組分別以50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L TMP處理細胞24 h，用無血清的DMEM培養液重懸細胞，接種于預先鋪好Matrigel基質膠的96孔板，6×105個/孔，各孔設置3個復孔，將培養板置于搖床，緩慢作用30 min，陰性對照組加入同等體積的細胞培養液。以PBS洗掉未粘附的細胞，將粘附細胞以4%多聚甲醛固定15 min，加入0.1%結晶紫染液，清洗，風干，以0.2%TritonX-100溶解，在酶標儀測定各孔吸光度（OD490 nm）。細胞粘附率=（實驗組OD490 nm/陰性對照組OD490 nm）×100%

1.3 TMP對HepG-2細胞遷移和侵襲的影響 取HepG-2細胞，經 50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L TMP 處理 24 h，用無FBS的 DMEM培養基調整細胞密度為 5×105個 /ml，在Transwell上室加入200 μl細胞懸液，在Transwell下室加入20%FBS的培養基600 μl，培養24 h，PBS洗滌Transwell小室細胞3次，以棉簽擦去上室未穿過去的細胞，加入4%多聚甲醛固定15 min，用PBS洗3次，加入0.1%Giemsa染色30 min，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞遷移情況，拍照并記錄，計算HepG-2細胞遷移抑制率；在Transwell小室外膜均勻涂抹纖維粘連蛋白50 μl，風干后，再于內膜涂抹Matrigel稀釋液30 μl，37℃過夜凝膠。取不同濃度川芎嗪處理的HepG-2細胞進行常規洗滌、消化，1 000 r/m離心5 min，收集細胞，用無FBS培養基調整細胞密度為1.5×106個/ml，其他步驟同上。于倒置相差顯微鏡下觀察細胞侵襲情況，拍照并記數，計算HepG-2細胞遷移和侵襲抑制率（抑制率=（陰性對照組-實驗組）遷移或侵襲細胞數/陰性對照組遷移或侵襲細胞數×100%

1.4 培養上清液MMP-2和TIMP-2蛋白水平測定 取不同濃度的TMP處理的HepG-2細胞和陰性對照組細胞，分別經0.25%胰蛋白酶消化，調整細胞數至1×106個/ml，取細胞懸液1 ml，分別加入兔抗MMP-2和兔抗TIMP-2 100 μl，室溫孵育30 min，以無血清培養基洗滌1次，1 500 r/m離心10 min，棄上清，加入二抗 100 μl，室溫孵育 30 min，以無血清培養基洗滌1次，1 500 r/m離心10 min，棄上清。將細胞用PBS 0.1 ml重懸，銅網過濾后，上流式細胞儀測定蛋白水平，激發波長488 nm，應用Expo 32 ADC系統分析免疫熒光數據，蛋白相對水平取均值。

1.5 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TMP對HepG-2細胞粘附能力的影響 與陰性對照組比，藥物處理組HepG-2細胞粘附率明顯降低（P＜0.05）；與50 mg/L TMP組比，100 mg/L和200 mg/L TMP組HepG-2細胞粘附率明顯降低（P＜0.05，表1、圖1）。

圖1 TMP對HepG-2細胞粘附能力的影響（n=3）與陰性對照組比，*P＜0.05

2.2 TMP對HepG-2細胞侵襲和遷移能力的影響 隨著TMP濃度的加大，HepG-2細胞侵襲和遷移數量逐漸降低；與陰性對照組比，100 mg/L和200 mg/L TMP處理HepG-2細胞遷移和侵襲細胞數明顯降低，而遷移和侵襲抑制率顯著升高（P＜0.05）；與50 mg/L TMP組比，100 mg/L和200 mg/L TMP處理組細胞遷移數和侵襲細胞數明顯降低（P＜0.05，表1、圖2）。

表1 TMP對HepG-2細胞粘附、遷移和侵襲（n=3，）的影響

圖2 TMP對HepG-2細胞侵襲能力的影響

2.3 TMP對HepG-2細胞MMP-2和TIMP-2蛋白表達的影響 與陰性對照組比，實驗組細胞MMP-2蛋白表達和MMP-2/TIMP-2比值明顯降低，TIMP-2蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與 50 mg/L TMP 組比，200 mg/L TMP 處理細胞MMP-2蛋白表達和MMP-2/TIMP-2比值明顯降低，TIMP-2蛋白表達明顯升高（P＜0.05，表2）。

表2 TMP對HepG-2細胞MMP-2和TIMP-2蛋白表達（n=3，）的影響

3 討論

TMP 具有廣譜抗腫瘤作用[6-9]。研究顯示[10，11]，TMP 可有效抑制乳腺癌MCF-7細胞、肺癌A549細胞的體外增殖，其作用機制主要包括抑制腫瘤新生血管形成、抑制腫瘤細胞增殖、逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性等[12]。

本研究實驗結果顯示，隨著TMP濃度的增大，HepG-2細胞的粘附率明顯降低，細胞遷移和侵襲細胞數量明顯減少，提示TMP能有效降低HepG-2細胞的侵襲和遷移能力，且呈劑量依賴性[13，14]。本研究結果還顯示，隨著TMP濃度的加大，細胞MMP-2蛋白表達量逐漸降低，而TIMP-2蛋白表達量逐漸升高。

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