肝細(xì)胞癌組織miRNA-155水平變化及其對預(yù)后的影響

左芳，朱中梁，汪宏良

本文通過檢測HCC癌組織miRNA-155水平，分析了不同miRNA-155水平患者的預(yù)后情況，以探討檢測肝癌組織miRNA-155對HCC患者預(yù)后的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年1月～2014年5月我院收治的50例HCC患者，男28例，女22例；年齡為38～78歲，平均年齡為（57.92±8.16歲）。符合2005年世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。對手術(shù)切除的肝癌組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，根據(jù)Edmondson分級標(biāo)準(zhǔn)[2]，Ⅰ級10例，Ⅱ級15例，Ⅲ級12例，Ⅳ級13例。另取50例正常肝組織（肝血管瘤32例，肝破裂18例）作為對照組，男30例，女20例；年齡42～75歲，平均年齡（56.28±8.16歲）。

1.2 肝組織miRNA-155檢測 采用熒光定量PCR法檢測。Trizol試劑（廣州國奧生物技術(shù)有限公司）；qRT-PCR試劑盒miScript system（美國 Qiagen公司）；ABI7700定量PCR儀（美國PE公司）；氯仿、異丙醇、無水乙醇等未特殊說明的試劑均為Sigma公司產(chǎn)品。PCR方法[3]：采用液氮碾磨所需肝組織標(biāo)本，采用Trizol試劑一步法提取組織總RNA。使用紫外分光光度計檢測總 RNA的A260/A280比值在1.8～2.0。依據(jù)hsa-miR-155 miScript system試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR實驗。逆轉(zhuǎn)錄體系為20μl，按下列條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：37℃ 60 min，95℃ 5 min。PCR反應(yīng)體系也為20μl，按以下條件在ABI7700定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)：起始激活 95℃15 min；94℃15 s，55℃30 s，70℃30 s，共 30 個循環(huán)。RNA U6作為內(nèi)參，反應(yīng)條件同上。實驗重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)運用RQ=2-△△Ct方法進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 18.0軟件處理，計量資料以（±s）表示，采用 t或方差檢驗，計數(shù)資料采用 x2檢驗，繪制ROC曲線確定miR-155對HCC預(yù)后的預(yù)測價值的最佳截斷點，采用 Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，采用 Cox回歸行多因素分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分級HCC和正常肝組織miRNA-155水平比較 癌組織miRNA-155水平明顯高于正常肝組織，且隨著HCC分級的增高其miRNA-155水平也升高，組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1、表1）。

2.2 ROC曲線分析 根據(jù)術(shù)后患者生存情況繪制miR-155判斷HCC患者預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果顯示以miR-155=2.5為截斷點，其AUC為0.919，判斷患者生存的敏感性、特異性、陰性預(yù)測值和陽性預(yù)測值分別為91.3%、93.5%、85.3%和88.6%（圖2）。

2.3 肝細(xì)胞癌患者生存情況 對50例HCC患者隨訪2年，平均生存時間為20.6±4.6個月，2年生存12例（24.0%）；17例肝組織miRNA-155在2.5以上者平均生存期為9.4±2.8個月，2年僅生存3例（10.71%），則表明肝組織miRNA-155高水平患者其生存率明顯低于miRNA-155低水平患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 肝組織miR-155水平

泳道1:對照組；2:HCCⅠ級；3:HCCⅡ級；4:HCCⅢ級；5:HCCⅣ級

表1 不同分級HCC組織與正常肝miRNA-155水平（±s）比較

表1 不同分級HCC組織與正常肝miRNA-155水平（±s）比較

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與對照組比，①P＜0.05；與 HCC Ⅰ級比較，②P＜0.05；與HCC Ⅱ級比較，③P＜0.05；與HCC Ⅲ級比較，④P＜0.05

2.4 影響HCC患者預(yù)后的單因素分析 通過單因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)不同HCC分級、不同腫瘤大小、腫瘤是否轉(zhuǎn)移、是否靜脈侵犯、不同腫瘤分化程度和高低肝組織miRNA-155水平患者間生存期均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，表2）。

2.5 影響HCC患者預(yù)后的多因素分析 通過多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積大、腫瘤轉(zhuǎn)移、靜脈侵犯、腫瘤高分化和癌組織miRNA-155高水平為影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05，表3）。

圖2 miR-155對HCC預(yù)后預(yù)測的ROC曲線

表2 影響HCC患者預(yù)后的單因素分析

表3 影響HCC患者預(yù)后的多因素分析

3 討論

本文通過多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑＞5 cm、發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移、靜脈侵犯、腫瘤細(xì)胞呈高分化和腫瘤組織miRNA-155高水平均為影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素。

miRNA-155是一種典型的多功能基因，屬于一種潛在的致癌或抑癌基因，其下游基因可介導(dǎo)如炎癥、免疫造血細(xì)胞的分化及心血管疾病等多種病理生理過程[4-8]。既往研究表明，乳腺癌組織miRNA-155水平與正常乳腺組織存在明顯差異，結(jié)果提示miRNA-155水平與腫瘤的病理特征和生物學(xué)特征相互聯(lián)系[9]。也有研究者證實miRNA-155在胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞株高水平存在，隨后還發(fā)現(xiàn)其可作為診斷早期胰腺癌的重要標(biāo)志物之一[10-12]。除此之外，也有資料報道[13-17]，在腎透明細(xì)胞癌患者的癌組織及頭頸部和甲狀腺癌組織miRNA-155也較正常組織明顯升高。由此看來，miRNA-155與腫瘤的發(fā)展有著密不可分的關(guān)系，并可在一定程度上促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。但是，在目前研究領(lǐng)域，關(guān)于miRNA-155在HCC組織中的水平及其與HCC患者預(yù)后的關(guān)系尚未完全清楚，也缺乏足夠大量的研究報道[18]。本研究結(jié)果提示正常肝組織miRNA-155水平明顯低于肝癌組織，與既往研究一致[19]。在肺癌研究中，發(fā)現(xiàn)miRNA-155與肺鱗癌患者預(yù)后密切相關(guān)。隨著miRNA-155水平的升高，肺腺癌A549細(xì)胞和非鱗癌H157細(xì)胞增殖加快，表明miRNA-155可促進(jìn)肺癌的發(fā)展[20]。本研究采用ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)miR-155相對水平在2.5時對HCC患者預(yù)后具有較高的預(yù)測價值。本研究顯示，miRNA-155較低水平（＜2.5）的 HCC患者其術(shù)后2 a生存率明顯高于miRNA-155高水平（＜2.5）的HCC患者，且通過多因素Cox回歸分析得知miRNA-155高水平屬于HCC患者預(yù)后差的獨立危險因素之一。我們的研究發(fā)現(xiàn)miRNA-155在術(shù)前高水平患者術(shù)后生存率顯著低于術(shù)前低水平者。由此，我們推測miRNA-155對HCC患者的預(yù)后有一定的意義，其高水平可促進(jìn)HCC的發(fā)展。我們還發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小、腫瘤分化和腫瘤轉(zhuǎn)移等均是影響患者術(shù)后生存的獨立危險因素，我們認(rèn)為，這些因素對miR-155的表達(dá)可能有影響，可以進(jìn)一步作深入研究。

綜上所述，肝癌組織miRNA-155水平明顯高于正常肝組織，且高水平的miRNA-155為HCC患者預(yù)后差的獨立危險因素。肝癌組織miRNA-155水平高低可評估HCC患者的預(yù)后，是否可考慮將其作為評估HCC患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子，尚需進(jìn)一步研究。

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