非酒精性脂肪性肝病患者糞便鈣衛(wèi)蛋白檢測(cè)及其意義*

楊釗，魏娟，吳曉辰，王少東，汪芳裕，楊妙芳

鈣衛(wèi)蛋白（FC）是一種主要由中性粒細(xì)胞釋放的鈣-鋅結(jié)合蛋白，其含量占中性粒細(xì)胞胞漿蛋白的60%以上[1-4]。當(dāng)腸道粘膜發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，中性粒細(xì)胞遷移、聚集到腸道炎癥部位，并釋放更多的鈣衛(wèi)蛋白，后者在腸道蠕動(dòng)過(guò)程中與腸道內(nèi)容物混合，最

終隨糞便排出體外，因而FC水平可反應(yīng)胃腸道內(nèi)中性粒細(xì)胞的遷移情況[5-7]。FC具有抗細(xì)菌降解的能力，在常溫下可穩(wěn)定存在長(zhǎng)達(dá)7天。因此，F(xiàn)C水平可較為準(zhǔn)確地反映腸道的炎癥狀態(tài)[8，9]。FC可用于評(píng)價(jià)炎癥性腸病、腸道憩室病、結(jié)直腸癌、乳糜瀉等腸道疾病的炎癥狀態(tài)。FC水平還可用于鑒別炎癥性腸病與功能性腸病，評(píng)價(jià)炎癥性腸病的疾病活動(dòng)度，評(píng)價(jià)藥物治療效果等[10，11]。有研究者甚至認(rèn)為FC檢測(cè)可代替內(nèi)鏡檢查評(píng)估炎癥性腸病的炎癥狀態(tài)[12]。近年來(lái)，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在肝硬化患者，F(xiàn)C可作為篩查或評(píng)估自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎和肝性腦病的指標(biāo)[13，14]。FC還可用于評(píng)價(jià)系統(tǒng)性硬化病患者是否存在細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)[15]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，肥胖與腸道炎癥密切相關(guān)，通過(guò)控制飲食減肥可減輕結(jié)腸的炎癥程度[16]。肥胖者合并NAFLD的幾率可高達(dá)94%[17]。目前尚沒(méi)有關(guān)于NAFLD患者FC水平的報(bào)道。本研究檢測(cè)了NAFLD患者FC水平，以評(píng)估其腸道的炎癥狀態(tài)，進(jìn)而闡述腸道炎癥在NAFLD發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2015年9月～2016年4月在我院脂肪肝聯(lián)合專病門診就診的NAFLD患者，參照2010年修訂的非酒精性脂肪性肝病診療指南診斷[18]，納入標(biāo)準(zhǔn)為：①18歲～65歲，男女不限；②無(wú)飲酒史或飲酒折合乙醇量男性＜140 g/周，女性＜70 g/周；③肝臟超聲表現(xiàn)符合彌漫性脂肪肝的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①患酒精性肝病、病毒性肝炎、藥物性肝損傷、全胃腸外營(yíng)養(yǎng)、肝豆?fàn)詈俗冃浴⒆陨砻庖咝愿尾〉瓤芍轮靖蔚奶囟膊』蚝喜⒂行摹⒎巍⒛X、腎等嚴(yán)重疾病；②患有可引起FC升高的疾病，如腹瀉、炎癥性腸病、結(jié)腸癌、消化道出血或上、下消化道糜爛/潰瘍等；③近1月內(nèi)服用過(guò)非甾體類抗炎藥、抗凝藥、抗生素和質(zhì)子泵抑制劑等。選擇同期性別和年齡與NAFLD組相匹配的健康體檢人員作為正常對(duì)照。

1.2 一般資料的獲取 記錄研究對(duì)象的疾病史、飲酒史、藥物服用史等，測(cè)量血壓（mmHg）、腰圍（cm）、身高（cm）和體質(zhì)量（kg），并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)（BMI，kg/m2）。

1.3 標(biāo)本收集、處理及檢測(cè) 所有研究對(duì)象空腹留取新鮮靜脈血2 ml，并立即送至檢驗(yàn)科檢測(cè)。在此后3天內(nèi)留取新鮮糞便2 g以上（女性避開(kāi)月經(jīng)期），4℃轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室并儲(chǔ)存于-80℃待測(cè)。使用全自動(dòng)生化分析儀（日本東京，Hitachi 7600）對(duì)血液生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，指標(biāo)包括 ALT、GGT、堿性磷酸酶（ALP）、AST、空腹血糖、TG、TC、尿酸、HDL、低密 度脂蛋白（LDL，日本第一化學(xué)株式會(huì)社試劑盒）。采用ELISA法檢測(cè)糞便鈣衛(wèi)蛋白（瑞士Schnenbuch，Bühlmann）。稱取待測(cè)糞便50 mg，溶于提取液2450 μl中，混勻后靜置；30 min后，取上清液1 ml，2 000g離心5 min；取離心后上清液和標(biāo)準(zhǔn)品各100 μl，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)[19]。以FC水平大于50 μg/g為腸道存在炎癥。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 本研究納入NAFLD患者81例和正常人91例。本研究NAFLD患者多為中青年，體質(zhì)指數(shù)和腰圍均明顯大于健康正常人，NAFLD組肥胖率明顯高于正常人（P＜0.001），但兩組高血壓患病率相似。NAFLD組血生化指標(biāo)均顯著高于正常人（P＜0.01，表1）。

表1 兩組一般資料和血生化指標(biāo)（±s）比較

表1 兩組一般資料和血生化指標(biāo)（±s）比較

與正常人比，①P＜0.01

?

2.2 FC水平及其相關(guān)性分析 NAFLD組FC水平為 43.0（18.8～87.0）μg/g，顯著高于正常人的 11.4（4.6～24.4）μg/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.00，圖1）；NAFLD組和正常人FC水平大于50 μg/g者分別為48例（59.3%）和6例（6.6%），兩者構(gòu)成比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=55.178，P＜0.001）；相關(guān)性分析顯示，NAFLD患者FC水平與BMI、腰圍、血清GGT、TC 水平呈正相關(guān)（r=0.725，r=0.570，r=0.292，r=0.400，P 值均 ＜0.05，圖2A～D）。

圖1 NAFLD患者與正常人FC水平比較

圖2 NAFLD患者FC水平的相關(guān)性分析 均與FC水平顯著相關(guān)（P值均＜0.05）

2.3 多因素分析 將兩組年齡、性別以及在單因素分析中存在組間差異的指標(biāo)，包括BMI、腰圍、空腹血糖、尿酸、ALT、AST、GGT、TC、TG、HDL、LDL 和FC進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示低水平的血清HDL，高水平的血TG、BMI和TC為發(fā)生NAFLD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表2）。

表2 影響NAFLD發(fā)生因素的Logistic回歸分析

3 討論

腸-肝的概念于1978年首次被Volta提出[4]，后逐漸被認(rèn)為是腸與肝相互聯(lián)系相互作用的雙向通道[20]。腸道屏障作為腸-肝軸中的重要組成部分，在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Miele et al[21]采用免疫組化檢測(cè)ZO-1蛋白表達(dá)量，并檢測(cè)尿液51Cr-EDTA發(fā)現(xiàn)了NAFLD患者的腸道上皮細(xì)胞緊密連接被破壞，腸道通透性增加，他們認(rèn)為腸道屏障障礙在肝臟脂質(zhì)沉積中發(fā)揮了重要作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患兒腸道通透性大于正常兒童，并且與NAFLD的炎癥程度呈正相關(guān)[22]。

腸道炎癥可引起腸道通透性增加，進(jìn)而在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Gabele et al[23]在DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎的模型中，在高脂飼料喂養(yǎng)下，腸道炎癥促使脂多糖進(jìn)入門靜脈，最終使肝臟炎癥及纖維化加重。此外，Jiang在研究腸道微生態(tài)與NAFLD關(guān)系的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，腸道炎癥、腸道粘膜免疫功能障礙是腸道微生態(tài)失調(diào)作用于NAFLD的重要環(huán)節(jié)。與Jiang研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似，本研究也發(fā)現(xiàn)NAFLD患者多存在腸道炎癥。不同的是，Jiang使用透射電子顯微鏡觀察患者十二指腸緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)，并用免疫組化檢測(cè)緊密連接蛋白的表達(dá)量，而本研究使用的是更為簡(jiǎn)便且非侵入性的方法，即檢測(cè)患者糞便中鈣衛(wèi)蛋白水平，進(jìn)而評(píng)估腸道的炎癥狀況。

由于糞便與腸道黏膜直接接觸，糞便在腸道排出過(guò)程中可攜帶一些蛋白分子（如鈣衛(wèi)蛋白、乳鐵蛋白），因而用于反應(yīng)腸道炎癥狀態(tài)的糞便炎癥標(biāo)志物比血液中炎癥標(biāo)志物更具有優(yōu)勢(shì)[24]。目前研究發(fā)現(xiàn)，糞便中鈣衛(wèi)蛋白和乳鐵蛋白均能較好地評(píng)估腸道炎癥狀態(tài)，但有研究表明，使用FC比糞便乳鐵蛋白準(zhǔn)確性更高[25]，因而我們選用了FC來(lái)評(píng)估NAFLD患者的腸道炎癥狀態(tài)。在本研究中，NAFLD患者FC水平明顯高于正常人，雖然在多因素分析中，F(xiàn)C在兩組間的差異性不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（可能是樣本量不足的原因），但經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C與BMI、TC和GGT具有相關(guān)性，而肥胖、高脂血癥及肝功能異常都是NAFLD的常見(jiàn)臨床表現(xiàn)，且腸道炎癥與NAFLD的發(fā)病進(jìn)程密切相關(guān)。因此，我們認(rèn)為以FC評(píng)估NAFLD患者的腸道炎癥狀態(tài)，進(jìn)而指導(dǎo)NAFLD的臨床檢查及用藥具有一定的臨床應(yīng)用前景。當(dāng)然，其應(yīng)用價(jià)值仍需擴(kuò)大樣本量來(lái)進(jìn)一步研究。

本研究不足之處在于樣本量不夠大，非多中心研究，研究結(jié)果不能推及其它中心的NAFLD人群。

本研究發(fā)現(xiàn)NAFLD患者肥胖的比率明顯高于健康正常人，并且其肝功能普遍有所損害，血脂水平也顯著高于正常人。同時(shí)，本研究通過(guò)一種簡(jiǎn)便而非侵入性的方法，檢測(cè)研究隊(duì)列中FC水平，發(fā)現(xiàn)NAFLD患者FC水平顯著高于正常人，表明NAFLD患者存在腸道炎癥，為腸道炎癥在NAFLD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用提供了證據(jù)。為使本研究結(jié)論更可靠及更具有推廣性，未來(lái)需要加大樣本量并在多中心進(jìn)行研究，甚至可開(kāi)展NAFLD患者的電子內(nèi)鏡檢查以進(jìn)一步研究證實(shí)。

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