雙黃連對MHV-3誘導的暴發型肝衰竭小鼠的保護作用研究*

黃明，鄧衛平，彭敏，吳勝英

急性肝衰竭（ALF）病情危重兇險，病死率高[1，2]。動物實驗發現3型鼠肝炎病毒（murine hepatitis virus strain 3，MHV-3）可誘導小鼠暴發型肝炎，其病程和疾病預后與臨床急性肝衰竭相似，是研究病毒性肝炎重癥化重要的動物模型[3]。MHV-3感染宿主引起免疫反應，產生的炎癥介質IL-10可造成肝臟微循環障礙，在肝衰竭患者其水平通常會顯著升高，是ALF預后不良的獨立危險因素[4，5]。趨化因子IP-10屬于CXC類非 ELR亞族的趨化因子，其通過招募淋巴細胞歸巢，調控機體的免疫應答反應[6，7]。TGF-βl對肝功能衰竭及肝硬化的形成起到促進作用，TGF-βl水平直接反映肝纖維化程度，高水平的TGF-βl可能抑制肝細胞的再生和分化，而加速肝功能衰竭[8，9]。在ALF病理進程中，IP-10和TGF-βl均出現升高，并提示ALF患者肝細胞有嚴重的缺血缺氧性損傷，此時肝細胞大量壞死，導致肝功能加速衰竭[10-12]。目前，關于雙黃連對MHV-3誘導小鼠暴發性肝衰竭研究還鮮有報導。本實驗采用高壓水注射法將MHV-3注入BABL/cJ小鼠體內，制備ALF模型，觀察了雙黃連對小鼠肝組織IP-10 mRNA和血清MHV-3 DNA水平的影響，以探討抗病毒治療對ALF發病的阻斷作用。

1 材料與方法

1.1 動物、病毒株、藥物與試劑 36只6～7周齡雌性BABL/cJ小鼠，體質量14～18 g，由十堰市太和醫院肝病研究所提供[SCXK（京）2005-0013]。動物喂養在恒溫房（22℃，濕度50%～75%），單籠清潔級飼料喂養，12 h交替光照，自由飲水。實驗用MHV-3為Ⅲ型鼠肝炎病毒（十堰市太和醫院肝病研究所實驗室保存，滴度為1×106PFU/mL）。雙黃連（湖南新匯制藥股份有限公司，批號：20160226）。TRIZOL試劑（美國Invitrogen公司），PCR分析儀（美國 Roche公司），IP-10逆轉錄試劑盒和ELISA檢測試劑盒（上海麥約爾生物技術有限公司），檢測IL-10的ELISA試劑盒（上海美軒生物科技有限公司）。

1.2 ALF小鼠模型制備 將動物編號，采用隨機數字表法隨機分為對照組、模型組和雙黃連組（每組12只）。準確抽取滴度為1×106PFU/ml的MHV-3 200 μL，采用高壓水注射法經小鼠尾靜脈注入小鼠體內，造成小鼠急性感染，模擬ALF動物模型[13]。成模時間為48 h。ALF成模標準：在注射MHV-3第48 h時，經眶靜脈取血50 μL，采用實時定量RT-PCR法檢測MHV-3 DNA定量，以小鼠靜脈血MHV-3 DNA滴度≥1.3×103copies/ml為陽性標準；對照組經尾靜脈注射生理鹽水50 μL；根據Meeh-Rubner公式計算，雙黃連給藥劑量為750 mg·kg-1，先將雙黃連配制成10%混懸液備用。在造模后，給予10%雙黃連混懸液0.75 ml/10 g灌胃，1次/d，治療7 d。在對照組和模型組，給予等量的生理鹽水灌胃。

1.3 血清檢測 采用ELISA法檢測MHV-3標志物（上?？迫A生物技術公司）；使用全自動生化分析儀檢測血清AST和ALT；采用ELISA法檢測血清TGF-βl、IL-10、LN 和 HA 水平[13，14]；取靜脈血 50 μl，加入 DNase 10 μl混勻，37℃消化 l6 h。然后，采用乙戊醇抽提病毒DNA。上游引物：5'-ATAGGAACCTGTGAATCAG-3'，下游引物：5-GCCTTCCAACGACCTGAAAGACG-3'，檢測 MHV-3DNA。

1.4 肝組織IP-10 mRNA檢測 在造模后第48 h和治療7 d，采用RT-PCR法檢測小鼠肝組織IP-10 mRNA。IP-10上游引物：5’-ACGCTGCCCCA AAGCTAACGCTA-3'，下游引物：5'-GCCAACTTCG GTCAAGGAGCACT-3'，擴增產物長度為312 bp；GAPDH上游引物：5'-CATAACCTCCTCGTCGAG-3'，下游引物：5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3'，擴增產物長為 215 bp。反應條件：預變性95℃ 5 s，95℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，36 個循環；72℃終止延伸10 min[15]。

1.5 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，先行方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模情況 在第48 h時，模型組動物存活9只（75%），雙黃連組存活10只（83%）；對照組存活12只；模型組和雙黃連組存活小鼠血清MHV-3 DNA均為陽性，對照組均為陰性，說明造模成功。在7 d時，模型組動物存活4只，雙黃連組存活7只，對照組存活12只。

2.2 三組血清ALT和AST水平比較 在48 h和7 d時，模型組ALT和AST水平顯著升高，與對照組比，差異顯著（P＜0.05）；在 7 d時，雙黃連組 ALT和AST水平顯著降低，與模型組比，差異顯著（P＜0.05，表1）。

表1 三組肝功能指標（±s）比較

表1 三組肝功能指標（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

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2.3 三組血清LN和HA含量比較 在48 h和7 d時，模型組血清LN和HA含量顯著升高，與對照組比，差異顯著（P＜0.05）；在7 d時，雙黃連組LN和HA含量顯著降低，與模型組比，差異顯著（P＜0.05，表2）。

表2 三組血清LN和HA水平（±s）比較

表2 三組血清LN和HA水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

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2.4 三組血清TGF-βl和IL-10水平比較 在48 h和7 d時，模型組TGF-βl和IL-10顯著升高，與對照組比，差異顯著（P＜0.05）；在7 d時，雙黃連組TGF-βl和IL-10顯著降低，與模型組比，差異顯著（P＜0.05，表3）。

表3 三組小鼠血清TGF-βl和IL-10水平（±s）比較

表3 三組小鼠血清TGF-βl和IL-10水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只數IL-10（pg/ml）TGF-βl（pg/ml）對照組 48 h 12 0.98±0.07 87.54±9.20 7 d 12 1.01±0.05 83.73±10.34模型組 48 h 9 23.34±1.65① 312.09±33.26①7 d 4 25.70±3.87① 319.46±39.12①雙黃連組 48 h 10 24.39±2.04① 315.65±31.45①7 d 7 1.07±0.09② 93.87±11.20②

2.5 三組肝組織IP-10 mRNA和血清MHV-3 DNA滴度比較 在48 h和7 d時，模型組肝組織IP-10 mRNA和血清MHV-3 DNA滴度均顯著升高，與對照組比，差異顯著（P＜0.05）；在7 d時，雙黃連組IP-10 mRNA和MHV-3-DNA滴度均顯著降低，與模型組比，差異顯著（P＜0.05，表4）。

表4 三組肝組織IP-10 mRNA和血清MHV-3 DNA滴度（±s）比較

表4 三組肝組織IP-10 mRNA和血清MHV-3 DNA滴度（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

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3 討論

MHV-3屬冠狀病毒科，據其嗜組織特性的不同可分為呼吸株和嗜腸株，目前關于MHV-3感染后藥物干預的研究，特別是體內實驗未見報道。雙黃連具有明顯抗腺病毒、單純皰疹病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、輪狀病毒、柯薩奇病毒等的作用[16，19]。

本實驗中，模型組動物在造模后與治療7 d后，MHV-3-DNA在肝細胞大量復制增殖，肝細胞嚴重破壞，特別是IL-10大量分泌造成的肝細胞炎癥反應會進一步加重肝細胞變性、壞死。同時，由于IL-10誘導T細胞集聚，細胞免疫應答也加重炎癥反應，此時血清纖維化指標LN和HA均顯著升高、TGF-βl和IP-10 mRNA高表達。隨著病程進展，MHV-3-DNA大量增殖，肝臟組織最終發生纖維化，肝臟徹底喪失解毒功能而導致大量動物死亡。而雙黃連組在干預性治療7 d后，小鼠肝臟IP-10 mRNA低表達，血清MHV-3-DNA滴度顯著降低，血清纖維化指標中TGF-βl、LN和HA明顯降低，肝功中AST和ALT均明顯降低。在造模中所用的MHV-3具有誘導mfgl2凝血酶原酶基因轉錄活性作用[20]。雙黃連是否具有影響mfgl2凝血酶原酶基因轉錄還有待研究，但雙黃連組治療后血清IL-10降低、肝組織中IP-l0 mRNA低表達，肝功能中AST和ALT等酶都基本恢復正常，這一結果提示雙黃連抑制或者阻礙病毒激發相關的免疫損害而保護肝細胞。另有研究表明，抑制TGF-βl高表達可減輕肝纖維化，這也是治療ALF的關鍵[21]。雙黃連組血清LN、HA及TGF-βl較模型組明顯降低，提示雙黃連可能具有抑制肝膠原合成、降解肝星狀細胞、促進肝細胞再生、從而抑制纖維化進展、改善肝臟組織能量代謝而起促進肝功能恢復的作用。Kpolat等[22]研究表明，ALF患者IL-10分泌明顯增多，IL-10作為抗炎細胞因子，在ALF的免疫應答中能迅速控制病毒復制，抑制肝細胞急性損害，但IL-10過多分泌會拮抗T淋巴細胞中Thl型細胞因子分泌，這不利于病毒清除，還會造成機體對MHV-3細胞免疫減弱而導致MHV-3持續復制。而IP-l0在ALF的發生發展及肝臟的免疫損傷中也扮演著十分重要的角色，高表達的IP-l0可誘導大量效應性T淋巴細胞集聚至受MHV-3感染的肝細胞并清除之，但過度釋放的IP-l0會致炎癥反應擴大而加劇肝細胞損傷[23]。雙黃連組血清IL-10降低、肝組織中IP-l0 mRNA低表達，提示雙黃連可能通過直接抑制MHV-3在肝臟復制而減輕其對肝臟細胞的破壞。

綜上所述，雙黃連可在一定程度上抑制MHV-3病毒復制，降低IP-10 mRNA的表達、減輕IL-10對肝細胞的炎性損傷，阻止肝組織纖維化病變而發揮整體保護性效應，但其機制還有待進一步深入研究。

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