香附多糖對牛血清白蛋白誘導的肝纖維化大鼠血清MMP-2、TIMP-2和TGF-β1水平的影響

尚雙艷，高翔

肝纖維化是乙型肝炎等多種類型慢性肝炎發展至肝硬化的前期階段。盡管肝硬化為不可逆性病理學改變，但肝纖維化卻是一個相對可逆的病變過程，故在肝纖維化階段進行合理有效的干預是防治肝硬化的最有效途徑之一[1，2]，但如何尋找有效的抗肝纖維化的藥物是亟需解決的重要問題[3]。研究表明，多種中藥存在著較強的護肝活性，且有較好的開發前景[4]。香附具有理氣解郁、調經止痛之功效，主要用于治療肝郁氣滯，胸、脅、脘脹等[5]。盡管臨床對于香附水提物及多糖成分的研究較為廣泛，但將其用于抗肝纖維化的實驗卻鮮有報道。我們在牛血清白蛋白（BSA）誘導的肝纖維化大鼠，觀察了香附多糖的抗肝纖維化作用及其對大鼠血清基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、組織金屬蛋白酶抑制劑-2（TIMP-2）和轉化生長因子-β（TGF-β1）的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器、藥品和試劑 60只雄性SD大鼠【陜西省疾病控制中心，SCXK（陜）2016-1122】，體質量（120±10）g，室溫、55%濕度、日常光照、標準飼料、自由飲水喂養。SD-09型全自動生化分析儀（武漢邁瑞惠公司），NU-721型分光光度計（保定第三分析儀器廠），CV-8型電熱恒溫培養箱（北京一恒有限公司），C102型多管架全自動平衡離心機（合肥市第一儀器廠），BY-08型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊醫療設備有限公司）。BSA及福氏不完全佐劑（美國Sigma公司，武漢源聚有限公司進口、分裝，批號分別為997822和998912），秋水仙堿（昆明制藥股份有限公司，批號：2016110987），香附多糖（武漢健民制藥公司）。檢測MMP-2、TIMP-2和TGF-β1所需試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為97112301、97110923和 97116727）。

1.2 大鼠肝纖維化模型的建立[6]將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、秋水仙堿組、大劑量、中劑量和小劑量香附多糖組。在造模時，取9 g/L的BSA生理鹽水溶液與等量的福氏不完全佐劑混合，制備成乳懸液，取0.5 ml，皮下多點注射，第1次與第2次注射之間的時間間隔為2 w，隨后每隔1 w注射1次，共5次。然后，取BSA 0.2 mg尾靜脈注射，2次/w，注射3 w后，將BSA的注射劑量增至0.4 mg，2次/w，繼續注射 9次，共 15次，大鼠的造模時間為35 d。在造模成功后，分別給予秋水仙堿 0.1 mg·kg-1、香附多糖 200 mg·kg-1、100 mg·kg-1和50 mg·kg-1灌胃，在正常對照組和模型組則給予等量的生理鹽水灌胃，1次/d，共60 d。于末次給藥1 h后，用乙醚麻醉動物，經腹主動脈取血并制備血清。取左葉肝組織，經福爾馬林溶液固定，制片。

1.3 檢測 使用全自動血生化分析儀檢測血清生化指標；采用放射免疫分析法檢測血清肝纖維化指標（武漢博士德生物科技有限公司）；采用酶聯免疫分析法檢測血清MMP-2、TIMP-2和TGF-β1水平。

1.4 統計學處理 應用SPSS 22.0軟件處理數據，以（±s）表示計量資料，采用方差分析進行多組間資料的比較，采用t檢驗進行兩組間的比較。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織病理學表現 在光鏡下，正常對照組大鼠肝組織未見異常，肝小葉結構正常，肝細胞無變性壞死，無纖維結締組織增生；模型組大鼠肝小葉中央靜脈附近出現纖維結締組織增生，小葉內彌漫性纖維組織增生，肝小葉中央炎性細胞浸潤，肝細胞脂肪變性和灶性壞死；秋水仙堿和大劑量香附多糖處理組大鼠肝組織出現纖維化，但纖維結締組織僅限于匯管區，炎性細胞浸潤少，肝細胞未出現脂肪變性和灶性壞死；中劑量和小劑量香附多糖處理組大鼠肝組織存在纖維化，但纖維結締組織僅限于匯管區，或存在匯管區擴大現象，肝組織存在炎性細胞浸潤，但未到達肝小葉中央，肝細胞出現中等程度的脂肪變性和灶性壞死（圖1）。

2.2 各組大鼠血清肝功能指標的變化 對照組和秋水仙堿、大、中、小劑量香附多糖處理組大鼠血清AST和ALT水平均顯著低于模型組，而血清ALB水平則顯著高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）。

圖1 各組大鼠肝組織病理學表現（HE，400×）

2.2 各組大鼠血清肝纖維化指標比較 對照組和秋水仙堿、大、中、小劑量香附多糖處理組大鼠血清PC-Ⅲ膠原、Ⅳ-C膠原、LN和HA水平均顯著低于模型組，差異均有統計學意義（P＜0.05，表2）。

2.3 香附多糖對肝纖維化大鼠血清MMP-2、TIMP-2和TGF-β1的影響 對照組、秋水仙堿、大、中、小劑量香附多糖處理組大鼠血清MMP-2水平均顯著高于模型組，而血清TIMP-2與TGF-β1水平則均顯著低于模型組，差異均有統計學意義（P＜0.05，表3）。

表1 各組大鼠肝功能指標（±s）比較

表1 各組大鼠肝功能指標（±s）比較

與模型組比，①P＜0.05；與正常組比，②P＜0.05

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表2 各組大鼠血清肝纖維化指標（ng/ml，±s）比較

表2 各組大鼠血清肝纖維化指標（ng/ml，±s）比較

與模型組比，①P＜0.05；與正常組比，②P＜0.05

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表3 各組大鼠血清MMP-2、TIMP-2和TGF-β1水平（±s）比較

表3 各組大鼠血清MMP-2、TIMP-2和TGF-β1水平（±s）比較

與模型組比，①P＜0.05；與正常組比，②P＜0.05

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3 討論

肝纖維化是多類型慢性肝病發展至肝硬化的主要必經階段，其臨床發病率較高，若不及時有效治療可發展至肝硬化及肝癌，嚴重威脅患者生命健康[7，8]。隨著現代化中醫藥的不斷發展，傳統中藥用于肝纖維化的治療越發受到重視[9]。香附是一種莎草科多年生草本植物，廣泛分布于中國大部分地區，具有調經止痛、疏肝解郁之功效，常用于治療疝氣疼痛、乳房脹痛、脹滿疼痛、肝郁氣滯、胸脅脹痛、經閉痛經、脾胃氣滯、月經不調及脘腹痞悶等[10，11]。現代藥學研究結果表明，香附的化學成分極為復雜，且藥理作用廣泛，其中多糖成分具有抗炎、抗氧化應激等活性，生物堿成分具有較好的抗抑郁活性，而總黃酮則可有效降低糖尿病患者血糖水平[12-15]。鑒于香附多糖可有效緩解機體炎癥反應，改善氧化應激紊亂，而上述作用對于肝纖維化均具有重要意義，故我們用其防治肝纖維化，期望為該藥的研發及防治肝纖維化提供一定的依據。

BSA所致肝纖維化大鼠是藥學研究中常用的肝纖維化模型，主要是指在BSA的刺激下，肝臟星狀細胞（HSC）的活化和增殖能力增強，并逐漸轉變為成纖維細胞，造成肝臟細胞外基質（ECM）的合成及ECM異常沉積明顯增多，最終導致肝纖維化[16]。MMP-2是一類鋅鈣依賴性的蛋白水解酶，可有效降解肝臟組織中ECM，尤其是在IV型膠原的降解中具有至關重要的作用[17，18]。TIMP-2則可抑制MMP-2的降解ECM作用，由于MMP-2與TIMP-2之間的平衡對于機體調節ECM的作用非常重要，而長期炎癥刺激等各類型致病因素可引起HSC活化，造成MMP-2合成量降低，而TIMP1的合成量增高，導致合成的ECM降解降低，使其沉降于肝組織內，最終形成肝纖維化[19]。反之，減少機體內TIMP-2含量，增加MMP-2水平則可緩解甚至逆轉肝纖維化進程。TGF-β1是機體中具有多類型生物學活性的細胞因子，其能夠促進纖維基因的表達作用，同時該蛋白還可上調TIMPS的合成，抑制MMPS的活性，從而抑制ECM的降解，促進ECM的合成和沉淀，最終造成肝纖維化的形成[20]。

本研究血清學檢測結果顯示，大、中、小劑量香附多糖處理組大鼠血清ALT、AST、PC-Ⅲ膠原、Ⅳ-C膠原、LN、HA等水平均明顯低于模型組，且MMP-2含量均明顯高于模型組，而TIMP-2和TGF-β1水平明顯低于模型組，提示香附多糖可有效改善肝纖維化大鼠肝臟功能、緩解肝臟纖維化程度，對于疾病的恢復具有重要意義。本研究病理學檢查結果也顯示，香附多糖處理組大鼠肝組織纖維化情況明顯改善，證實了香附多糖可有效改善大鼠肝臟纖維化情況。然而，本研究仍存在香附多糖治療的具體作用機制尚不明確等諸多問題，后期還應該對其進行深入研究。

綜上所述，香附多糖對BSA所致的大鼠肝纖維化具有較好的防治作用，可有效改善大鼠肝臟功能，緩解肝纖維化程度，具有開發成為抗肝纖維化新藥的潛力。

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