小檗堿對內(nèi)毒素刺激致Caco-2細(xì)胞間高通透性的保護(hù)作用*

李鑫，王洪巖，遲程，徐有青

腸源性內(nèi)毒素血癥在酒精性肝病發(fā)生和進(jìn)展中的重要作用已被證實。長期飲酒引起腸道高通透性的主要原因為腸道菌群失調(diào)，革蘭陰性菌增多，內(nèi)毒素（endotoxin）入血，造成內(nèi)毒素血癥。目前研究已明確，慢性酒精攝入引起的腸道高通透性的原因并非腸上皮細(xì)胞的破壞或脫落，而是細(xì)胞間緊密連接（tight junctions，TJs）構(gòu)型改變，導(dǎo)致其透過率增加，大分子物質(zhì)，如內(nèi)毒素經(jīng)腸腔進(jìn)入血液，經(jīng)門靜脈到達(dá)肝臟進(jìn)而引起肝損傷。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)在酒精性肝炎小鼠，小檗堿（berberine，BBR）能減輕腸上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，改善“腸漏”，從而保護(hù)酒精性肝損傷。本實驗體外培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞（Caco-2細(xì)胞），加入脂多糖（LPS）模擬酒精刺激，檢測細(xì)胞間通透性、觀察緊密連接結(jié)構(gòu)形態(tài)和構(gòu)成蛋白的變化，以探討B(tài)BR對LPS刺激致Caco-2細(xì)胞間高通透性的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 Caco-2細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞庫。BBR、LPS、熒光黃購自Sigma公司,DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清等細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Gibico公司。兔抗occludin、抗Toll樣受體-4（TLR4）、抗MyD88單克隆抗體購自英國Abcam公司，BCA檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司,Western blot超敏發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司,細(xì)胞免疫熒光試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司,酶標(biāo)儀購自芬蘭Themo公司,DMLI型熒光顯微鏡（Leica公司），熒光分光光度計購自日本日立公司。

1.2 細(xì)胞分組與培養(yǎng) 取20～30代Caco-2細(xì)胞，用含有10 g/L非必需氨基酸、10 g/L谷氨酰胺、1 g/L丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)液，加入體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素常規(guī)培養(yǎng)。每7 d按1∶2傳代,傳代7 d后待細(xì)胞達(dá)融合狀態(tài)，分為4組,加入LPS模擬酒精刺激，處理時間為48 h：①對照組（培養(yǎng)基）；②LPS組（培養(yǎng)基 +LPS 2 μg/ml）；③BBR組（培養(yǎng)基 +BBR 10μM）；④BBR/LPS組（培養(yǎng)基 +LPS 2μg/ml+BBR 10μM）。

1.3 熒光黃透過性檢測 接種細(xì)胞于Transwell小室，實驗前測定跨上皮細(xì)胞電阻（trans epithelial electrieal resistanee，TEER），以驗證細(xì)胞融合狀態(tài)和腸上皮屏障的完整性，TEER不低于l00Ω.cm2提示腸上皮細(xì)胞屏障完整，再進(jìn)行實驗。各組處理48 h，吸去Transwell內(nèi)外的培養(yǎng)液，用HBSS液（pH 7.4）沖洗細(xì)胞3次，并在37℃孵育30 min，重新測量TEER值，TEER值降低不超過原測值的10%再繼續(xù)進(jìn)行試驗。在Transwell頂端腔內(nèi)加入含有終濃度為 100 μg/ml熒光黃的 HBSS 液 100 μl，37℃孵育4 h，收集腹側(cè)腔液體，在熒光分光光度計下測定吸光度（激發(fā)波長427 nm，發(fā)射波長536 nm）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算透過到基底側(cè)熒光黃的濃度。

1.4 細(xì)胞occludin和TLR4表達(dá)檢測 采用Western-blot法，收集細(xì)胞（約 2×106），PBS洗滌 2 次，加入裂解Buffer 300 μl，置冰上搖晃反應(yīng)30 min，行蛋白裂解，4℃，12 000 r/m離心，取上清。采用BCA法測蛋白濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜、顯影。調(diào)整不同處理細(xì)胞數(shù)量，使之蛋白總量一致。取蛋白60 μg，與5×加樣緩沖液混勻，100℃變性5 min，冷卻后上樣。恒壓電泳2 h，4℃下將樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST洗滌3次，每次5 min。5% 牛奶封閉纖維膜2 h，加入兔抗人 occludin 或抗 TLR4（1:400）,4℃過夜，TBST洗滌3次，加入連接有辣根過氧化物酶的羊抗兔IgG（1:4000），室溫下振蕩孵育2 h，TBST洗滌3次。在ECL試劑盒內(nèi)曝光、顯影。

1.5 細(xì)胞MyD88表達(dá)檢測 采用免疫熒光法，制備Caco-2細(xì)胞爬片，模擬腸上皮屏障。將玻片置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔底，將Caco-2細(xì)胞懸液滴加到爬片上，混勻，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞連接形成后，用于后續(xù)實驗。取出處理好的細(xì)胞爬片，用PBS緩沖液洗5 min，×3次；加4%多聚甲醛固定30 min，PBS緩沖液洗5 min，×3次；加0.3%Triton×100破膜15 min，PBS緩沖液洗 5 min，×3次；加 3%BSA封閉液封閉；將BSA吸干,將經(jīng)PBS緩沖液稀釋的兔抗 MyD88（1:200）滴加到爬片上，放入濕盒，4℃冰箱過夜；次日，經(jīng)PBS緩沖液洗5 min，×3次，將FITC熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG用PBS緩沖液稀釋后，滴加到爬片上，避光室溫孵育1 h，PBS緩沖液洗5 min，×3次；最后，用含有DAPI的封片劑封片，避光4℃保存，在熒光顯微鏡下觀察、照相。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（±s）表示，所有數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用成組資料的t檢驗,多組間比較采用LSD法行單因素方差分析，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長形態(tài)情況 在倒置顯微鏡下直接觀察，對照組和BBR組細(xì)胞連接完整，出現(xiàn)典型的鵝卵石樣輪廓；LPS組細(xì)胞外周輪廓模糊難辨，出現(xiàn)鋸齒樣斷裂，趨于變細(xì)、崩解、消散；BBR/LPS組細(xì)胞間緊密連接毛糙、少許點狀缺失，但無明顯的片狀中斷（圖1）。

圖1 細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn) （倒置顯微鏡，200×）

2.2 細(xì)胞間透過性變化 通過檢測從頂端腔透過至基底側(cè)的熒光黃濃度，評估各組Caco-2細(xì)胞間通透性情況，結(jié)果BBR組基底側(cè)熒光黃濃度為849.0±89.7 μg/ml，與對照組（683.3±98.9 μg/ml）比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.067）；LPS組透過熒光黃濃度為（1886±176.0 μg/ml），較對照組顯著升高（P=0.026）；在BBR/LPS共培養(yǎng)組，透過熒光黃濃度為（1071.0±65.9 μg/ml），較LPS組顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.043，圖2），提示BBR能顯著改善細(xì)胞間通透性。

圖2 各組細(xì)胞透過熒光黃濃度比較

2.3 細(xì)胞occludin和TLR4蛋白表達(dá)情況 對照組和BBR組occludin均呈高表達(dá)，LPS組occludin表達(dá)減弱，而BBR/LPS組較LPS組表達(dá)增強；TLR4與occludin表達(dá)情況相反，LPS組TLR4表達(dá)最強，對照組和BBR組表達(dá)最弱，而BBR/LPS組介于兩者之間（圖3）。

圖3 各組細(xì)胞occludin和TLR4蛋白表達(dá)情況

2.4 Caco-2細(xì)胞MyD88表達(dá)情況 經(jīng)熒光檢測，發(fā)現(xiàn)MyD88在細(xì)胞漿表達(dá)。對照組、BBR組胞漿MyD88無明顯表達(dá)，LPS/BBR組綠色熒光在胞漿呈中等度表達(dá)，而LPS組則呈高表達(dá)。LPS組胞漿MyD88表達(dá)顯著高于對照組和BBR組。與LPS組比，LPS/BBR組MyD88表達(dá)減弱（圖4）。

圖4 各組細(xì)胞MyD88蛋白表達(dá) 蛋白呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光（免疫熒光，100×）

3 討論

Caco-2來源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，可分化成有極性的腸上皮細(xì)胞。本研究應(yīng)用Caco-2細(xì)胞株（20～30代）建立腸上皮細(xì)胞屏障模型，在研究屏障損傷機制時，有助于排除體液和神經(jīng)因素的影響[1]。

目前，關(guān)于酒精性肝炎發(fā)病機制的研究，一般認(rèn)為有乙醇代謝產(chǎn)物對肝細(xì)胞的直接損傷、氧化應(yīng)激、鐵沉積、鋅缺乏等因素參與[2，3]。但近年來，隨著對腸道菌群、益生菌和益生元等研究的深入，腸源性內(nèi)毒素血癥在酒精性肝炎發(fā)生進(jìn)展中的作用逐漸受到重視[4-6]。在體內(nèi)試驗中發(fā)現(xiàn)，慢性飲酒會引起腸道內(nèi)革蘭陰性菌聚集，釋放LPS增加，大量LPS經(jīng)腸道入門靜脈到達(dá)肝臟，最終導(dǎo)致酒精性肝損傷。所以，在體外實驗中，我們用LPS模擬酒精刺激，觀察細(xì)胞形態(tài)及檢測細(xì)胞間通透性。在倒置顯微鏡下直接觀察細(xì)胞生長形態(tài)，發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞連接完整，出現(xiàn)典型的鵝卵石樣輪廓，而LPS組細(xì)胞間連接部分模糊難辨，出現(xiàn)鋸齒樣斷裂，趨于變細(xì)、崩解、消散，而細(xì)胞本身未見壞死、凋亡。熒光黃是大分子物質(zhì)，不能通過正常細(xì)胞間連接。當(dāng)各種因素引起細(xì)胞本身破壞或細(xì)胞間結(jié)構(gòu)破壞時，大分子物質(zhì)，如熒光黃、LPS可以透過。所以，本實驗通過檢測熒光黃透過性評價細(xì)胞間通透性大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS組透過熒光黃濃度較對照組顯著升高，提示LPS組細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)被破壞。

腸上皮屏障是由腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞間連接復(fù)合體組成，TJs是最重要的連接復(fù)合體并負(fù)責(zé)調(diào)整細(xì)胞間通透性[7]。Occludin蛋白是TJs的主要結(jié)構(gòu)蛋白。TLR4是內(nèi)毒素特異性抗體，與內(nèi)毒素結(jié)合后可引起細(xì)胞間TJs構(gòu)型改變，在調(diào)節(jié)自身免疫應(yīng)答、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著重要作用。在通常情況下，腸上皮細(xì)胞膜TLR4的微量表達(dá)對致病因素有防御作用[8]，但是，持續(xù)大量的TLR4表達(dá)會誘發(fā)消化道炎癥，進(jìn)而產(chǎn)生一系列疾病[9，10]。我們既往在小鼠的研究中已發(fā)現(xiàn)酒精處理組動物腸上皮細(xì)胞較對照組細(xì)胞膜TLR4表達(dá)顯著增加，occludin構(gòu)型改變，在細(xì)胞膜分布減少，細(xì)胞間通透性增加[11，12]。本實驗亦發(fā)現(xiàn)LPS刺激增加了細(xì)胞膜TLR4及胞漿中下游分子MyD88的表達(dá)，使occludin表達(dá)減少。

BBR又名黃連素，是一種異喹啉類生物堿,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等活性[13，14]。在消化科多用于治療腸道感染所致的炎性腹瀉，具有無細(xì)胞毒、無致突變作用、不良反應(yīng)小、價格低廉等優(yōu)點。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿經(jīng)口服吸收，能緩解腸粘膜炎性反應(yīng)[15]，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的腸上皮細(xì)胞凋亡，從而減輕放療[16]、酗酒、吲哚美辛[17]引起的腸黏膜損傷。有人[18，19]還發(fā)現(xiàn)BBR作為LPS的拮抗劑能阻斷LPS/TLR4信號通路。在2型糖尿病大鼠模型中，BBR通過調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，改善了腸道免疫屏障，減輕了糖尿病大鼠腸道高通透性[20]。

為了研究BBR對LPS刺激致Caco-2細(xì)胞間高通透性的保護(hù)作用，本實驗比較了LPS組和LPS/BBR組細(xì)胞間連接形態(tài)和細(xì)胞間通透功能，發(fā)現(xiàn)LPS組細(xì)胞連接處出現(xiàn)鋸齒樣斷裂，而BBR/LPS組雖連接毛糙，但無明顯中斷。LPS/BBR組透過熒光黃濃度較LPS組下降。LPS組與對照組比較，TLR4/MyD88表達(dá)增加，occludin表達(dá)明顯減少，在BBR/LPS共培養(yǎng)的細(xì)胞，TLR4和MyD88表達(dá)較單純LPS刺激組減弱，occludin表達(dá)增多。以上結(jié)果提示BBR可通過減弱TLR4/MyD88活性，增加TJ主要結(jié)構(gòu)蛋白Occludin的表達(dá)，從而穩(wěn)定細(xì)胞間緊密連接，進(jìn)而改善LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞間高通透性。

綜上所述，LPS刺激增加了腸上皮細(xì)胞TLR4/MyD88活性，減弱了細(xì)胞膜occludin蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞間通透性增加。BBR可通過減弱TLR4/MyD88活性，增加occludin表達(dá)進(jìn)而減輕細(xì)胞間高通透性。

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