固定化嗜麥芽寡養(yǎng)單胞茵的高效聚磷效果及應(yīng)用研究

佘夢林 張鉦 馬衛(wèi) 倪紅

摘要：為尋找能循環(huán)去除富磷廢水的生物材料，以篩選鑒定出的高效聚磷菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌為材料，測定了該菌的生長曲線，并采用鉬銻抗比色法測定該菌的聚磷曲線，比較了游離的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌和海藻酸鈣包埋茵小球?qū)Σ煌瑵舛群讖U水的聚磷效果。結(jié)果表明：游離菌處理5、10、15和20mg/L的舍磷廢水24h后，聚磷率分別達到97.8%，96.3%，85.3%和70.7%;即游離菌處理10mg/L含磷廢水，24h即可達到排放標(biāo)準(zhǔn)（TP

關(guān)鍵詞：嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌;聚磷茵;固定化;聚磷效果;應(yīng)用

中圖分類號：X799.3

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-9944（2018）10-0038-04

1引言

水體中磷的含量能夠決定藻類和水生植物的生物量。一旦水體中的磷（以P0i計）含量超過0.3mg/L，就會刺激藻類和水生植物的迅猛生長口，導(dǎo)致下層植物光合作用受阻;水中的溶氧量迅速降低;魚類及其它生物大量死亡。因此，如何降低和處理水體富營養(yǎng)化（Eutrophication）一直是當(dāng)今水污染研究的熱點問題。

生物除磷技術(shù)是指利用生物在生長代謝過程中對磷的吸收、吸附作用達到除磷目的。生物法除磷的運行費用較低，裝置自動化水平高，效果突出，不會出現(xiàn)二次污染和污泥膨脹現(xiàn)象，與化學(xué)絮凝過程相比優(yōu)勢顯著，對治理水體富營養(yǎng)化具有重要意義口。生物除磷主要包括微藻類除磷、水生植物除磷和微生物除磷三類。目前，有關(guān)微生物除磷技術(shù)的研究最為廣泛。有一類微生物能夠在好氧環(huán)境下從外界過量吸收可溶性磷酸鹽，并以多聚磷酸鹽（Poly-P）的形式貯存;厭氧環(huán)境下，這類微生物可以通過釋放體內(nèi)的多聚磷酸鹽獲得能量，供自身新陳代謝所需，這種現(xiàn)象即Luxuryuptake。人們把具有Luxuryuptake生物特性的微生物統(tǒng)稱為聚磷菌（Polyphosphate Accumulating Organisms，PAOs），并將其廣泛應(yīng)用于污水的生物除磷技術(shù)。

本室從磷化工污水處理廠的活性污泥中，篩選鑒定出一株具有高效聚磷作用的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，以該菌株為材料，測定了該菌株的生長曲線和聚磷曲線，并采用固定化包埋方法，制備成海藻酸鈉包埋菌小球，同時測定了游離菌和包埋小球處理不同濃度磷廢水的聚磷效果，最后設(shè)計了磷循環(huán)處理的固定化反應(yīng)器，對廢水的處理效果進行了嘗試，為該菌株更好地凈化磷廢水，提供了實驗依據(jù)。

2材料和方法

2.1微生物菌株

本室從某污水處理廠活性污泥中，篩選的高效聚磷嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophdia）作為實驗菌株。

2.2主要儀器與試劑

722N型可見分光光度計（上海精科實業(yè)有限公司）、IT-09A5型磁力攪拌器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、DHL-D恒流泵（上海馳唐電子有限公司）、氯化鈣（CaCl2）、海藻酸鈉（分析純）、抗壞血酸（分析純）、鉬酸銨（分析純）、過硫酸鉀（分析純）、酒石酸銻鉀（分析純）均購于國藥化學(xué)集團化學(xué)試劑有限公司。

2.3培養(yǎng)基

聚磷培養(yǎng)基：葡萄糖10g、（NH4）2SO40.5g、KC10.3g、NaC10.3g、FeS04·7H200.03g、MnS04.4H200.03g、CaCO35g和KH2PO40.0439g，蒸餾水定容至1000mL。用于測定菌株聚磷一生長曲線。

模擬廢水培養(yǎng)基：葡萄糖0.3g、蛋白胨0.1g、酵母粉0.01g、CH3COONaO.15g、NaCl0.05g、MgS04·7H800.15g、NH4C10.18g，KH2P04（以P計：10mg/L，0.0439g;以P計：20mg/L，0.0878g），蒸餾水定容至1000mL，pH值為7.0。用于菌株的聚磷性能測定。

2.4實驗方法

2.4.1嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的生長曲線和聚磷曲線

將活化后制備的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的種子液（OD600=1.0）按2%（V/V）接種至液體聚磷培養(yǎng)基（P含量為10mg/L）中，放入28℃、150r/min搖床振蕩培養(yǎng)48h。每隔一段時間取樣1mL，12000r/min離心5mm，菌體用PBS重懸后，測定OD600nm，并按GB11893-89-鉬銻抗比色法測定上清液的P濃度，測定結(jié)果重復(fù)3次，并計算聚磷率。聚磷率的計算方式如下：

聚磷率（%）=（1-X/X。）×100 （1）

式（1）中，X。為P（磷酸鹽）的初始濃度;X為P（磷酸鹽）的殘留濃度，繪制菌株在一個生長周期（48h）內(nèi)的生長曲線和聚磷曲線，分析細菌的生長量與聚磷率的關(guān)系。

2.4.2游離菌處理不同濃度含磷廢水的聚磷效果實驗

測定了不同濃度的含磷廢水（5、10、15、20mg/L）對菌聚磷效果的影響。將菌種子液（OD600nm=1.0）按10%的接種量轉(zhuǎn)接至200mL的模擬廢水培養(yǎng)基（以P計：5、10、15和20mg/L）中，于28℃、150r/min條件下培養(yǎng)。在12、24、36、48、60h幾個時間點取樣lmL離心（12000r/min，5min），測定上清液的磷濃度，測定結(jié)果重復(fù)三次，計算聚磷率，計算方法同上。

2.4.3海藻酸鈣包埋嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌小球的制備和對

為了提高菌株MET70的除磷性能和循環(huán)性能，參照文獻制備海藻酸鈣包埋菌小球：稱取2g海藻酸鈉溶于30mL無菌水中，加熱溶解后冷卻至室溫，靜置消泡。將菌活化并制成ODBOD=1.0的菌懸液，與上述海藻酸鈉溶液等體積混合均勻，無菌水定容至100mL。用50mL注射器將上述混合液緩慢滴入4%的CaCl2溶液中，交聯(lián)固定8h后濾出固定化小球，用生理鹽水多次洗滌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ苽浜Ｔ逅徕}空白小球時將上述菌懸液換成等量無菌水，其余方法相同。

分別稱取2g固定化包埋菌小球，放入裝有200mL的含磷廢水（P濃度分別為5、10、15和20mg/L）的500mL錐形瓶中，在28℃、150×10-0搖床中處理。分別在12、24、36、48和60h幾個時間點取樣離心（12000×10-6，5min），測定上清液的磷濃度，測定結(jié)果重復(fù)3次，計算聚磷率，計算方法同上。另稱取2g海藻酸鈣空白小球加入P濃度為20mg/L的含磷廢水，體系和條件如上，測定空白小球?qū)α椎奈饺萘?，排除海藻酸鈣空白小球?qū)α孜降母蓴_。

2.4.4包埋茵小球反應(yīng)器處理磷廢水效果的初步實驗

將制備出的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌固定化小球按照一定的填充量（100g），置于直徑10cm，高度30cm的反應(yīng)柱子中，100mL、50mg/L磷廢水的流速60滴/min，溫度為30℃，pH值為7，包菌量為1.2%，3次循環(huán)處理后，測定聚磷效果，測定方法同2.4.1。

3結(jié)果與分析

3.1嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的生長曲線和聚磷曲線

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌在液體聚磷培養(yǎng)基（P含量為10mg/L）中，28℃、150×10-6下培養(yǎng)48h。不同時間點對菌的生長量及相應(yīng)的聚磷率作圖，得到菌的生長曲線和聚磷曲線，見圖1。

由圖l可知，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的聚磷效率隨培養(yǎng)時間的變化而改變：當(dāng)0～6h時，菌生長處于適應(yīng)期，菌體生長速度緩慢（ODBODnm=0.06），無顯著聚磷效果;當(dāng)6～12h時，菌進入對數(shù)生長期，此時菌濃度0600ⅡⅢ迅速增至0.95，聚磷效率由8.8%提高到89.5%;當(dāng)12～28h時，菌生長趨于穩(wěn)定，聚磷速率較對數(shù)期變緩，當(dāng)菌株到達最大生長量（OD600nm=l.572）時上清液P濃度降到最低，約0.47mg/L，此時菌的聚磷率達到最高，為95.58%;在隨后的48h內(nèi)菌的生長量處于動態(tài)平衡，培養(yǎng)液的P濃度略有上升的趨勢，但總體趨于穩(wěn)定。

結(jié)果還表明，菌的聚磷能力與生長量緊密相關(guān)，菌體生長代謝越旺盛，聚磷能力越強;另一方面，菌株的聚磷能力并不是隨著培養(yǎng)時間的延長而增強，在培養(yǎng)后期，由于次生代謝產(chǎn)物的積累和營養(yǎng)的缺乏，菌株生長進入衰亡期，部分菌體裂解會導(dǎo)致胞內(nèi)的P釋放，使環(huán)境中的P含量有所回升。

3.2嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌對不同濃度含磷廢水的聚磷效果實驗

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌在不同時間（12、24、36、48和60h）內(nèi)，對P含量為5、10、15、20mg/L四個不同濃度的廢水的除磷效果如圖2所示。

由圖2可知，模擬廢水中的磷濃度不同，菌的聚磷能力也不相同：游離菌處理5、10、15、20mg/L的含磷廢水24h后，聚磷率分別為97.8%和96.3%，85.3%和70.7%。即游離菌處理低濃度（P≤10mg/L）的含磷廢水時，24h內(nèi)可以滿足《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB8978）中的一級排放標(biāo)準(zhǔn)，即TP

結(jié)果還表明，隨著模擬廢水中磷含量的增加，游離菌的除磷效率雖然有所下降，但磷的總積累量有所上升，說明MET70能夠隨外界環(huán)境的改變提高自身的聚磷性能，有較好的開發(fā)利用潛力;同時聚磷性能在24h達到穩(wěn)定，這與菌的生長特性相吻合，即環(huán)境生長量達到最大時，除磷效率最高。

3.2海藻酸鈣包埋菌小球的制備和對不同濃度含磷廢水

按上述方法制備的海藻酸鈣空白小球和海藻酸鈣包埋菌小球如圖3所示。將海藻酸鈣空白小球投入P含量為20mg/L的廢水中，測定空白小球在不同時間（12、24、36、48和60h）點的聚磷率（見圖4）。

由圖4可知，空白小球?qū)α子幸欢ǖ奈阶饔?，?4h即達到吸附平衡，此時的空白小球聚磷率為41.66%，最大吸附容量約為8.33mg/L。

海藻酸鈣包埋菌小球按1%的質(zhì)量體積處理P含量為5、10、15、20mg/L4種不同濃度的廢水，測定出不同時間（12、24、36、48和60h）下的聚磷率如圖5所示。

由圖可知，與游離菌和空白小球處理相比，MET70的固定化小球?qū)δM廢水的聚磷能力進一步提升：包埋小球處理5mg/L和10mg/L的含磷廢水12h后，聚磷率達到最高，分別為99.9%和98.9%;包埋小球在處理15mg/L和20mg/L的含磷廢水48h后，聚磷率達到最高，分別為98.2%和98.54%，且后期的除磷效率起伏變化較小，幾乎無釋磷現(xiàn)象。

實驗結(jié)果表明，海藻酸鈉包埋MET70小球的聚磷能力優(yōu)于空白小球和游離菌。在處理含磷量為5、10、15、20mg/L四種濃度的污水時，MET70包埋小球最終都能夠滿足《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB8978）中的一級排放標(biāo)準(zhǔn)（TP<0.5mg/L）;且在處理低濃度（P≤10mg/L）的含磷廢水時，包埋小球的處理時間較游離菌縮短了12h;在處理較高濃度（10

3.3包埋菌小球反應(yīng)器處理磷廢水效果的初步實驗

為探討包埋菌小球在廢水處理中的實際應(yīng)用，初步設(shè)計了磷廢水循環(huán)處理的工藝流程，如圖6所示。初步用測定了該裝置在30℃、pH值為7、包菌量為1.2%條件下，處理100mL、50mg/L含磷廢水，經(jīng)過3次循環(huán)處理后，測定聚磷率為87%。說明固定化包埋小球用于循環(huán)處理廢水，效果比較顯著。

4討論

4.1嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的聚磷性能實驗

在研究嗜麥芽寡養(yǎng)單胞茵聚磷特性的實驗中，菌株的除磷效果與生長量緊密相關(guān)，因此在實際處理污水過程中，應(yīng)考慮菌株生長和聚磷最佳的平衡點，才能最大限度的發(fā)揮菌株的應(yīng)用價值;另一方面，菌的聚磷容量會隨著外界環(huán)境的磷含量升高而增大，可能是磷濃度的增加刺激了聚磷微生物體內(nèi)磷酸激酶活性，從而使攝磷量得到提高。傳統(tǒng)聚磷菌株在污水的COD/P較小即有機物不足時，會由于自身生長受限導(dǎo)致處理效果不理想。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌能夠利用有機磷作為生長的唯一碳源，可以避免在處理過程中補充有機質(zhì)，造成二次污染。

4.2進一步完善磷廢水循環(huán)處理系統(tǒng)

用海藻酸鈣包埋嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌制成的包埋小球處理污水，雖然可以實現(xiàn)污水的除磷和解毒作用，但最終想達到安全排放標(biāo)準(zhǔn)，還要考慮反應(yīng)器處理過程中的最佳工藝條件，如進水的流速、氧氣的曝氣量、廢水的循環(huán)次數(shù)、處理的最佳磷含量、包埋小球機械強度與包埋生物活性的關(guān)系、聚磷效果的在線監(jiān)測等等，都有待進一步研究。