系統性紅斑狼瘡患者CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞的研究

王卓龍　　王芳　　王艷明

[摘要] 目的 研究SLE患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg 細胞變化。 方法 選取2015年1月～2018年3月在廣州醫科大學附屬第二醫院確診為系統性紅斑狼瘡56例患者和對照組體檢健康者30例，分別抽取外周靜脈血分離PBMC，加入FITC-單克隆鼠抗人CD19抗體、 PE-單克隆鼠抗人CD24抗體、 APC-單克隆鼠抗人CD38抗體， 室溫避光作用后，流式細胞儀檢測CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞。 結果 SLE患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞為（2.86±1.39）%，對照組為（4.07±1.48）%，兩組比較差異有統計學意義（t=3.781，P<0.01）。活動期、非活動期SLE患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg 細胞分別為（2.10±1.09）% vs （3.62±1.25）%，兩組比較差異有統計學意義（t=4.854，P<0.01）。10例SLE患者治療前、后外周血CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞分別為（2.28±1.24）% vs （3.34±0.78）%，兩組比較差異有統計學意義（t=4.386，P<0.01）。 結論 SLE患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞減少，可能參與SLE發病，可能是觀察療效的指標。

[關鍵詞] 紅斑狼瘡；系統性；調節性B細胞；CD19

[中圖分類號] R359.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）32-0015-04

Study on CD19+CD24hiCD38hiBreg cells in the patients with systemic lupus erythematosus

WANG Zhuolong WANG Fang WANG Yanming

Department of Rheumatology，the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510260， China

[Abstract] Objective To study the changes of CD19+CD24hiCD38hiBreg cells in the peripheral blood of patients with SLE. Methods A total of 56 patients with systemic lupus erythematosus （SLE） who were diagnosed in the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University and 30 healthy subjects in the control group from January 2015 to March 2018 were selected. The peripheral venous blood was drawn to separate PBMC. The FITC-monoclonal mouse anti-human CD19 antibody， PE-monoclonal mouse anti-human CD24 antibody， and APC- monoclonal mouse anti-human CD38 antibody were added. After staying away from light at room temperature， CD19+CD24hiCD38hiBreg cells were detected by flow cytometry. Results The CD19+CD24hiCD38hiBreg cells in the the peripheral blood in patients with SLE were （2.86±1.39）%， and the control group was（4.07±1.48）%. The difference between the two groups was statistically significant（t=3.781， P<0.01）. The CD19+CD24hiCD38hiBreg cells in the peripheral blood during the active and inactive phase in SLE patients were（2.10±1.09）% vs （3.62±1.25）%， respectively. The difference between the two groups was statistically significant（t=4.854， P<0.01）. CD19+CD24hiCD38hiBreg cells in the peripheral blood of 10 patients with SLE before and after treatment were（2.28±1.24）% vs（3.34±0.78）%， respectively. The difference between the two groups was statistically significant（t=4.386， P<0.01）. Conclusion The decrease of CD19+CD24hiCD38hiBreg cells in the peripheral blood of patients with SLE may be involved in the pathogenesis of SLE， which may be an observation index of curative effect.

[Key words] Lupus erythematosus； Systemic； Regulatory B cells； CD19

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及全身多個器官系統的自身免疫性疾病，患者血清中存在抗核抗體（ANA）、抗雙鏈DNA抗體等多種自身抗體。目前人們治療SLE藥物包括糖皮質激素、羥氯喹、嗎替麥考酚酯、環磷酰胺等。雖然SLE預后獲得明顯改善，但是感染、腎功能衰竭、中樞神經狼瘡、早發血管硬化導致的心腦血管事件仍是其主要死亡原因[1]。CD4+ T淋巴細胞異常活化刺激B淋巴細胞不斷產生自身抗體是SLE發病的重要機制[1]。B淋巴細胞免疫耐受性被破壞是其發病重要原因[2]。以往認為，B淋巴細胞通過產生特異性抗體、提呈抗原產生共刺激分子活化T細胞并通過細胞因子發揮免疫作用，但近年來研究證實部分B淋巴細胞還能通過分泌IL-10、TGF-β等發揮調節免疫功能[3]。

CD19+CD24hiCD38hiBreg是分泌IL-10的主要B淋巴細胞，它具有抑制免疫應答的重要功能[4]。目前有關CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞與SLE之間關系尚不清楚，患者經治療后其變化情況未見報道[5，6]。因此我們開展本研究以探討SLE患者CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞變化意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

（1）SLE組：選取2015年1月～2018年3月在廣州醫科大學附屬第二醫院住院或門診患者56例，其中男3例，女53例，年齡18～48歲，平均（26.8±6.8）歲，SLE病程1個月～6年，平均病程（23.4±21.9）個月。入選標準：符合美國風濕病協會1997年修正的關于SLE診斷標準[7]。排除標準：合并有其他風濕性疾病（如類風濕關節炎、干燥綜合征、硬皮病）、感染性疾病、腫瘤等。（2）對照組：體檢健康者30例，其中男2例，女28例，年齡18～49歲，平均（29.4±8.3）歲。兩組的年齡、性別比經統計學檢驗無顯著性差異（P>0.05），具有可比性。

根據SLEDAI評分對SLE患者分組[8]：（1）活動期SLE：SLEDAI評分≥5分，28例，其中男2例，女26例，年齡18～46歲，平均（27.1±6.9）歲。（2）非活動期SLE：SLEDAI評分<5分，28例，其中男1例，女27例，年齡18～48歲，平均（26.7±6.8）歲。兩組的年齡、性別比等比較無顯著性差異（P>0.05），具有可比性。

本研究獲得廣州醫科大學附屬第二醫院倫理委員會通過并取得研究對象的知情同意。

1.2 材料

淋巴細胞分離液購自天津灝陽生物制品公司。FITC-單克隆鼠抗人CD19抗體、PE-單克隆鼠抗人CD24抗體、APC-單克隆鼠抗人CD38抗體購自eBioscience公司。多聚甲醛固定液購自Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 外周血單個核細胞（Peripheral blood mo-nonuclear cell，PBMC）分離 分別抽取患者和對照組外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝，加等體積淋巴細胞分層液于15 mL錐形離心管。Ficoll-Hypaque 密度梯度離心法分離PBMC。

1.3.2 CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞檢測 取上述分離PBMC，加入FITC-單克隆鼠抗人CD19、 PE-單克隆鼠抗人CD24、 APC-單克隆鼠抗人CD38，室溫避光作用30分，PBS洗滌。離心后去上清液、重懸細胞，1%多聚甲醛固定，Navios流式細胞分析儀檢測。同時設同型對照、單陽對照。

1.3.3 其他 抗核抗體（ANA）、抗ds-DNA抗體、抗Sm抗體檢查采用免疫熒光法。

1.4 統計學方法

采用SPSS19.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。計數資料以%表示，采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson相關性檢驗。P<0.05（雙側）為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SLE患者CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞變化

流式細胞分析儀檢測CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞設門見圖1。SLE組CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞為（2.86±1.39）%，對照組CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞為（4.07±1.48）%。兩組比較，SLE組CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞水平明顯低于對照組，差異有統計學意義（t=3.781，P<0.01）。

2.2 活動期SLE組和非活動期SLE組CD19+CD24hi CD38hi Breg細胞比較

活動期SLE組外周血CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞為（2.10±1.09）%，非活動期SLE組外周血CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞為（3.62±1.25）%。兩組比較，活動期SLE組外周血CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞水平明顯低于非活動期SLE組，差異有統計學意義（t=4.854，P<0.01）。

2.3 SLE患者CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞治療前后比較

10例活動期SLE患者治療前外周血CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞為（2.28±1.24）%，經治療3～6個月后病情好轉，復查外周血CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞為（3.34±0.78）%。兩組比較，治療后SLE患者外周血CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞水平高于治療前，差異有統計學意義（t=4.386，P<0.01）

2.4 相關分析

SLE患者外周血CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞表達與血清補體C3（r=0.165，P=0.224）、補體C4（r=0.019，P=0.889）、IgG（r=0.127，P=0.352）、IgA（r=0.191，P=0.158）、IgM（r=0.157，P=0.247）、抗ds-DNA抗體（r=0.111，P=0.416）均無相關性。

3 討論

傳統B淋巴細胞通過產生特異性抗體、提呈抗原產生共刺激分子活化T細胞并通過細胞因子發揮免疫作用。1974年Katz等在接觸性皮炎小鼠模型中發現小鼠脾臟B淋巴細胞能夠抑制遲發型超敏反應[9]。這種B淋巴細胞與傳統B淋巴細胞不同，它們對免疫應答和炎性反應有調節作用，被命名為調節性B細胞（regulatory B cell，Breg）[4，10]。

Breg分為IL-10-producing Breg、TGF-β producing Breg、Foxp3-expressing Breg[11]。IL-10-producing Breg 通過分泌IL-10影響B淋巴細胞和致病性T細胞之間的相互作用而抑制病理性免疫反應[3，12]。TGF-β producing Breg 通過分泌TGF-β等發揮調節免疫作用，Foxp3-expressing Breg表達Foxp3發揮調節免疫作用[11]。

隨著對調節性B細胞深入研究，目前人們已經知道在人類CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞是分泌IL-10的主要B淋巴細胞[13]。其在多種自身免疫性疾病如膠原誘導關節炎[14，15]、炎癥性腸病[16]、1型糖尿病[17]和實驗性自身免疫性腦脊髓炎[18]中發揮著重要的免疫調節作用。

本研究發現SLE患者外周血CD19+CD24hiCD38hi Breg減少，活動期SLE組外周血CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞水平低于非活動期SLE組，結果與文獻報道類似[5]。其減少機制尚不明確，有待進一步研究。

CD19+CD24hiCD38hi Breg免疫負調節功能在SLE患者中可能發生改變。正常人CD40組成性表達于成熟B細胞。體外實驗證實在CD40受刺激后，CD19+CD24hiCD38hiBreg分泌IL-10而抑制Thl細胞分化[6]；抑制CD4+輔助性T細胞分泌干擾素（IFN-γ）和腫瘤壞死因子（TNF-α）的作用；通過TGF-β1使CD4+CD25-效應T細胞轉化為 CD4+FoxP3+Tregs[19]。SLE患者外周血CD19+CD24hiCD38hi Breg對CD40的刺激反應降低，分泌IL-10減少，缺乏正常人體內這類細胞亞群的抑制作用[5，6]。

CD4+ T細胞過度活化刺激B淋巴細胞產生ANA、抗ds-DNA抗體等多種自身抗體是SLE重要發病機制[1]。CD19+CD24hiCD38hi Breg由于數量減少和功能變化，導致其免疫負調節功能受損，不能抑制CD4+ T細胞過度活化，可能參與SLE的發病過程。

本研究還發現，SLE患者經治療病情好轉后，外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞較前明顯上升，顯示其可能是病情好轉的一個觀察指標，值得進一步研究。

綜上所述，SLE患者外周血CD19+CD24hiCD38hi Breg減少，可能起著免疫負性調節功能參與SLE發病，可能是觀察療效的指標，有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] George CT. Systemic lupus erythematosus[J]. N Engl J MED，2011，（365）：2110-2121.

[2] Pieterse E，Vlag VDJ. Breaking immunological tolerance in systemic lupus erythematosus[J].Frontiers in Immunology，2014，（5）：164.

[3] Filatreau S，Sweenie CH，Mcgeachy MJ，et al. B cells regulate autoimmunity by provision of IL-10[J]. Nat Immunol，2002，3（10）：944-950.

[4] Mauri C，Ehrenstein MR. The short history of regulatory B cells[J]. Trends Immuno， 2008，29（1）：34-40.

[5] 蔡小燕，李欣穎，林小軍，等.調節性B細胞在系統性紅斑狼瘡患者外周血中的表達[J].中華醫學雜志，2015， 95（17）：1310-1313.

[6] Blair PA，Norena LY，Flores BF，et al. CD19+CD24hiCD38hi B cells exhibit regulatory capacity in healthy individuals but are functionally impaired in systemic lupus erythematosus patients[J]. Immunity，2010，32（1）：129-140.

[7] Hochberg MC. Updating the American college of rheumatology revised criteria for the classi cation of systemic lupus erythematosus[J]. Arthritis Rheum，1997，40（9）：1725.

[8] Bombardier C，Gladman DD，Urowitz MB，et al. Derivation of the SLEDAI. A disease activity index for lupus patients. The committee on prognosis studies in SLE[J]. Arthritis Rheum，1992，35（6）：630-640.

[9] Katzs S，Parker D，Turk JL.B-cell suppression of delayed hypersensitivity reactions[J]. Nature，1974，251（5475）：550-551.

[10] Wolf SD，Dittel BN，Hardardottir F，et al.Experimental autoimmune encephalomyelitis induction in genetically B cell-deficient MICE[J]. J EXP MED，1996，184（6）：2271-2278.

[11] Noh J，Choi WS，Noh G，et al. Presence of Foxp3-expressing CDl9（+）CD5（+） B cells in human peripheral blood mononuclear cells：Human CDl9（+） CD5（+） Foxp3（+） regulatory B cell（Breg）[J].Immune NETW，2010，10（6）：247-249.

[12] Hsieh J，Williams P，Rafei M，et al. Inducible IL10+ suppressor B cells inhibit CNS inflammation and T helper 17 polarization[J]. Molecular Therapy，2012，20（9）：1767-1777.

[13] Mauri C，Menon M.The expanding family of regulatory B cells[J]. International Immunology，2015，27（10）：479-486.

[14] Manri C，Gray D，Mushtaq N，et al. Prevention of arthritis by interleukin 10-producing B cells[J]. J EXP MED，2003， 197（4）：489-501.

[15] Yang M，Deng J，Liu Y，et al. IL-10-producing regulatory B10 cells ameliorate collagen-induced arthritis via suppressing Th17 cell Generation[J].Am J Pathol，2012， 180（6）：2375-2385.

[16] MizoguchiI A，MiznguchiI E，Smith RN，et al. Suppressive role of B cells in chronic colitis of T cell receptor alpha mutant mice[J].J EXP Med，1997，186（10）：1749-1756.

[17] Hussain S，Delovitch HL.Intravenous transfusion of BCR-Activated B cells protects NOD mice from type 1 diabetes in an IL-10-dependent manner[J]. J Immunol，2007， 179（11）：7225-7232.

[18] Monica KM，Maresz K，Shriver LP，et al. B cell regulation of CD4+CD25+T regulatory cells and IL-10 via B7 is essential for recovery from experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Immunol，2007，178（6）：3447-3456.

[19] Wang WW，Yuan XL，Chen H，et al. CD19+CD24hiCD38hiBregs involved in downregulate helper T cells and upregulate regulatory T cells in gastric cancer[J]. Oncotarget，2015，6（32）：33486-33499.

（收稿日期：2018-06-22）