CA15-3在犬乳腺腫瘤中的表達及其臨床意義

刁洪秀 ， 張 潤 ， 林德貴 ， 張 迪

(1.中國農業大學動物醫學院 ， 北京海淀100193 ； 2.中國農業大學動物醫院 ， 北京海淀100193)

犬乳腺腫瘤(Canine mammary tumor, CMT)是未絕育母犬最常見的腫瘤之一，其中約有41%～53%的病例惡性程度較高，嚴重危及寵物的生命健康[1]。在獸醫臨床中，乳腺腫瘤的診斷包括臨床癥狀檢查、X射線檢查、組織病理學檢查等，但對早期乳腺癌診斷價值有限。乳腺癌病因尚不確定，且早期癥狀不明顯，因此，早診斷、早治療是預防乳腺癌的有效手段。糖鏈抗原15-3(CA15-3)是一種高糖基化跨膜蛋白，在多數腫瘤組織中高表達，其胞外結構域在某些因素的刺激下會脫落進入血液循環，現已成為人醫臨床乳腺癌診斷和監測的生物標志物之一[2]，但在獸醫臨床上尚未見報道。因此，本研究以CA15-3為研究對象，檢測其在健康犬和乳腺腫瘤患犬的組織和血清中是否存在差異，分析其在犬乳腺腫瘤中的作用和臨床意義，為小動物乳腺腫瘤的診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本 所有樣本均來自于2014年到2015年期間來本校動物醫院就診的病例。共收集乳腺腫瘤病例40例(10.26±2.5歲)，參照WHO發布的CMT國際組織學分級和Goldschmidt等[3，4]在2011年提出的CMT分類和分級標準進行組織學分類，即實體癌7例、混合癌6例、單純乳腺小管癌5例、單純乳頭小管狀癌3例、簡單腺癌1例、癌肉瘤1例、惡性肌上皮瘤1例、腺鱗癌1例、混合腺瘤8例、良性混合瘤3例、腺瘤2例以及增生2例。健康犬33例(7.65±3.9歲)，所有犬均為雌性。

1.2 主要試驗試劑和儀器 CA15-3 ELISA試劑盒，購自Biocheck公司；CA15-3單克隆抗體，購自Novus公司；SP-9002生物素-鏈霉卵白素免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。酶標儀、切片機、組織包埋機、烤片機、光學顯微鏡等。

1.3 試驗方法

1.3.1 血清中CA15-3的檢測 犬后肢隱靜脈采血2 mL，促凝管中靜置10 min，2 500 r/min離心10 min，取上清于1.5 mL EP管中，參照CA15-3 ELISA試劑盒說明書操作。

1.3.2 組織中CA15-3的檢測 石蠟切片經過脫水、抗原修復、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色等過程進行免疫組織化學(IHC)檢測。

免疫組織化學染色結果判讀標準：CA15-3蛋白陽性信號主要集中在腺泡上皮和導管上皮頂膜和胞漿中，出現黃色或棕黃色顆粒為陽性染色。對每個IHC樣本隨機選5個視野進行拍照，采用Image Pro Plus對照片平均光密度值進行分析。

1.3.3 統計學分析 應用SPSS18.0對數據進行獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，數據以平均數±標準差表示，P<0.05為差異顯著。

2 試驗結果

2.1 犬血清中 CA15-3含量的檢測結果 犬血清樣本中CA15-3濃度及其與臨床病理因素的關系見表1。由表1可知，健康犬和乳腺腫瘤患犬血清中CA15-3濃度分別為5.72 U/mL±4.82 U/mL、15.70 U/mL±12.93 U/mL，兩者之間差異顯著(P<0.05)。乳腺腫瘤患犬中，血清中CA15-3濃度在不同年齡、不同病理類型和不同組織分級中無統計學差異(P>0.05)。經病例回訪發現，預后良好和死亡的病例中，CA15-3濃度依次為12.49 U/mL± 8.04 U/mL, 22.84 U/mL±11.12 U/mL，兩者之間存在統計學差異(P<0.05)。

表1 乳腺腫瘤患犬血清CA15-3水平與臨床病理因素的關系

注：同一病理因素，數據肩頭字母不同表示差異顯著，P<0.05

2.2 犬乳腺組織中CA15 -3蛋白的表達 乳腺組織中CA15-3 部分IHC結果及其與臨床病理因素的關系，見中插彩版圖1和表2。正常乳腺組織中，CA15-3在乳腺上皮細胞中呈低表達。在乳腺腫瘤組織中，幾乎所有樣本均呈現中度到強陽性表達，胞漿和胞核著色較深，染色區域呈彌散狀或顆粒狀。使用Image Pro Plus軟件計算所有樣品的平均光密度(MOD)發現，CA15-3 MOD在乳腺腫瘤組織中要明顯高于健康犬乳腺組織(P=0.008)，I 級、II 級、III 級腫瘤組織中，CA15-3 MOD值均存在統計學差異(P<0.05)，在不同年齡和不同病理分型中，CA15-3 MOD值不存在統計學差異(P>0.05)。經病例回訪發現，不同預后結果之間，組織 CA15 -3蛋白表達沒有顯著差異(P>0.05)。

3 討論

在人醫臨床上，腫瘤生物標志物的檢測已成為繼影像學診斷和組織病理學診斷之后, 臨床最常用的腫瘤診斷方法之一。CA15-3是乳腺的相關抗原，存在于多種腺癌細胞內，是診斷乳腺癌較特異的標志物[5]。美國臨床腫瘤學會于2007年將CA15-3推薦為乳腺癌預防、診斷及隨訪的重要腫瘤標志物之一[6]，但在獸醫臨床上鮮有報道。本試驗中，40例乳腺腫瘤患犬血清中CA15-3濃度要明顯高于健康犬，盡管乳腺腫瘤患犬血清CA15-3 濃度在不同病理類型和組織分級中不存在統計學差異，但在惡性腫瘤中其平均濃度上升了59.38%，且隨著組織分級的加劇，其含量不斷升高，說明CA15-3 同樣適用于犬乳腺腫瘤的診斷。在預后回訪中發現，死亡病例血清中CA15-3濃度要遠高于預后良好的動物，說明血清CA15-3與犬乳腺腫瘤的預后有關。另外，在乳腺組織CA15-3 IHC結果中發現，CA15-3在乳腺腫瘤中的陽性檢出率幾乎是100%，且胞漿、胞膜和胞核呈中度到強陽性表達。以往的研究發現[7-8]，腫瘤組織中CA15-3主要呈胞漿內過表達，但也有文獻說[9]，在細胞微環境發生變化時，CA15-3的胞內部分可能會脫落至細胞核，具體的作用機制還需進一步探討。乳腺腫瘤組織中CA15-3 MOD值與病理分級密切相關，隨著組織學分級的加劇明顯上調，這與血清中CA15-3的結果相一致，說明組織中CA15-3的表達與犬乳腺腫瘤組織學分級具有明顯的相關性。

表2 組織中CA15-3與犬乳腺腫瘤臨床病理因素的關系

注：同一病理因素，數據肩頭字母不同表示差異顯著，P<0.05

4 結論

血清CA15-3可以作為犬乳腺腫瘤早期診斷和預后評估的生物標志物之一，組織中CA15-3的表達與腫瘤組織學分級密切相關，可作為評估犬乳腺腫瘤惡性程度的生物標志物之一。