抗炎通管湯對慢性輸卵管炎模型大鼠EGFR和ICAM-1表達(dá)的影響

戴春秀，莊曉蘋，葉婉純，葉人

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中醫(yī)科，浙江 溫州 325015；2.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 病理科，浙江溫州 325000；3.溫州市中心醫(yī)院 中醫(yī)科，浙江 溫州 325000）

臨床上慢性輸卵管炎是導(dǎo)致輸卵管不通的主要原因，不僅破壞輸卵管內(nèi)膜，還易導(dǎo)致管腔粘連、閉塞，使輸卵管及其周圍組織增生纖維化，甚至硬化、扭曲、粘連，最終影響精子、卵子的結(jié)合，及受精卵的游走，而引起不孕。據(jù)統(tǒng)計我國女性不孕癥中，因慢性輸卵管炎引起的占23.7%～35.7%[1]。而炎癥過程中，不僅表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）的高表達(dá)可增強上皮細(xì)胞對生長因子的反應(yīng)性，細(xì)胞間黏附分子-1（cell adhesion moieties，ICAM-1）更是對促進(jìn)白細(xì)胞浸潤至炎癥部位起著重要作用。因此在防治慢性輸卵管炎中，調(diào)控EGFR、ICAM-1的表達(dá)水平是非常必要的。本實驗研究抗炎通管湯對慢性輸卵管炎模型大鼠EGFR、ICAM-1表達(dá)的影響，為中藥防治慢性輸卵管炎提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：雌性SD大鼠60只，42～49日齡，體質(zhì)量170～210 g，SPF級，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物許可證編號：SYXK（浙）2010-0150。

1.1.2 實驗藥物：抗炎通管湯：由柴胡10 g、川芎12 g、黃芪10 g、浙貝母10 g、丹參10 g、莪術(shù)10 g、白花蛇舌草15 g、皂角刺10 g、敗醬草10 g、牡蠣30 g、炙鱉甲10 g、穿山甲3 g、地龍10 g等藥物組成，飲片從浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠購入，由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房制備。湯劑制成過程：將方中牡蠣、炙鱉甲、穿山甲加入一定量蒸餾水先煎30 min后，加入其余藥材一起煎煮，15～20 min后濃縮、過濾至40 mL（抗炎通管湯濃度為3.75 mg/mL），4 ℃冷藏備用。金剛藤顆粒，購自廣西潤達(dá)制藥股份有限公司。藥物制備方法：在26.7 mL注射用水中溶入7 g/袋顆粒（濃度為0.2625 g/mL）。

1.1.3 菌種及檢測試劑：金黃色葡萄球菌（菌種號：FSCC223005）、大腸埃希菌（菌種號：FSCC149006）、乙型溶血性鏈球菌（菌種號：FSCC225002），自北京東方賽瑞生物技術(shù)有限公司購入后，在溫州醫(yī)科大學(xué)微生物實驗室進(jìn)行擴增培養(yǎng)。兔抗鼠EGFR多克隆抗體（編號：BA0820）、兔抗鼠ICAM-1多克隆抗體（編號：PB0054）、羊抗兔IgG（編號：BA1039）、SABC免疫組織化學(xué)試劑盒（編號：SA1022）、DAB顯色試劑盒（編號：AR1022）均由武漢博士德生物工程有限公司提供。熒光定量試劑盒（SYBR Select Master Mix，貨號：4472905）購自美國Life Technologies公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：k1622），購自美國Thermo Fisher Scientific公司。試劑Total購自美國Invitrogen公司；組織RNA分離、擴增試劑盒購自上海Ambion公司；并由上海生工生物工程有限公司完成引物設(shè)計與合成。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組：雌性SD大鼠60只，隨機數(shù)字表法分成正常組、模型組、金剛藤顆粒組、抗炎通管湯（低、中、高劑量）組同，每組10只。正常組：輸卵管注射0.9%氯化鈉溶液，注射用水灌胃2 mL；模型組：輸卵管注射混合菌液，注射用水灌胃2 mL；金剛藤顆粒組：輸卵管注射混合菌液，金剛藤顆粒灌胃2 mL；抗炎通管湯（低、中、高劑量）組：輸卵管注射混合菌液，分別給予濃度為9.375 g/kg（低劑量）、18.75 g/kg（中劑量）及37.5 g/kg（高劑量）抗炎通管湯灌胃2 mL。各給藥組于造模后第11天分別灌胃給藥，連續(xù)用藥20 d。在給藥第21天處死大鼠，取雙側(cè)輸卵管組織。

1.2.2 慢性輸卵管炎大鼠模型制備：采用混合菌株接種法[2]制作慢性輸卵管炎大鼠模型。按照50 mg/kg 2%戊巴比妥鈉劑量要求，腹腔注射麻醉模型大鼠，腹部剪毛，消毒鋪巾，逐層開腹，在兩側(cè)輸卵管處分別注入混合制備菌液（約4麥?zhǔn)希?0 μL，正常組則以0.9%氯化鈉溶液20 μL代替，關(guān)腹，依次縫合創(chuàng)口。肉眼觀察造模后第11天輸卵管組織樣本，4%多聚甲醛固定，石蠟常規(guī)包埋切片，HE染色，觀察各標(biāo)本鏡下組織學(xué)改變。

1.2.3 檢測方法：①免疫組織化學(xué)：用4 μm厚度連續(xù)切片，進(jìn)行標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色、脫蠟后，用不同濃度的乙醇分別浸泡，蒸餾水洗滌2次；用3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶20 min，洗滌2次，3次浸泡在PBS溶液（每次5 min）；高壓鍋抗原修復(fù)：以0.01 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH 6.0）作為抗原修復(fù)液，置于高壓鍋出氣后2 min快速冷卻；浸泡PBS液中3次（每次5 min）；兔抗鼠一抗加入稀釋，4 ℃過夜，浸泡PBS液中3次（每次5 min）；羊抗兔二抗滴入，37 ℃孵育30 min，浸泡PBS液中3次（每次5 min）；DAB顯色；自來水反復(fù)沖洗，蘇木素復(fù)染，分級乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。以PBS作陰性對照，陽性標(biāo)本作陽性對照觀察。②新鮮組織樣本RNA提取及純化：按照試劑盒要求提取總RNA；RNA溶解：純化的RNA以60 U/L elution洗脫溶解，分裝20 μL用于檢測RNA質(zhì)量和反轉(zhuǎn)錄，其余-80 ℃存儲備用。③實時熒光定量PCR檢測新鮮組織樣本中EGFR、ICAM-1表達(dá)量：嚴(yán)格按試劑盒使用說明操作，采用SYBR Green I染料法進(jìn)行。EGFR上游引物序列：5'-CAGTTTTCTCTGGCGGTTGT CG-3'，下游引物序列：5'-TGCAGTCCTTTTCAGCTCTGT TGTT-3'；ICAM-1上游引物序列：5'-CTGGAGAGCACAAA CAGCAGAGAT-3'，下游引物序列：5'-ATGGGAGCTGAAAAG TTGTAGATTC-3'；以β-actin基因為內(nèi)參，上游引物序列：5'-CTGAACCCTAAGGCCAACCG-3'，下游引物序列：5'-GACCAGAGGCATACAGGGACAA-3'。實驗在20 μL系統(tǒng)中開始，各0.5 μL 2×QuantiTect SYBR Green 10 μmol/L的上下游引物、1 μL cDNA樣本、8 μL RNA酶滅活水、l0 μL SYBR Green Master Mix。熱循環(huán)如下：95 ℃、5 min；95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，45個循環(huán)；25 ℃、5 min，42 ℃、60 min，70 ℃、5 min。

1.2.4 結(jié)果解讀：①免疫組織化學(xué)EGFR和ICAM-1表達(dá)位點：細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。陽性：胞漿或胞膜褐色顆粒。切片在光鏡下測量采用高倍鏡選取慢性輸卵管炎癥組織、正常輸卵管組織，統(tǒng)一焦距及光強后進(jìn)行數(shù)碼攝像，取5個高倍視野區(qū)域，用Image Pro Plus 6.0軟件分析，計算疊加陽性區(qū)域光密度總量及面積總和，兩者相除，得到單位面積平均光密度（OD）值，而相同切片5個視野的光密度均數(shù)為片中EGFR、ICAM-1所示的表達(dá)強度。②實時熒光定量PCR檢測新鮮組織中EGFR、ICAM-1 mRNA表達(dá)量：選擇合適的基準(zhǔn)線，各熒光曲線與準(zhǔn)線的交叉點即為Ct值，同一準(zhǔn)線下Ct值越小，熒光信號的基因拷貝數(shù)也就最早達(dá)到一定閾值。用β-actin作為參考基因，利用2-△△Ct方法解釋靶基因和參考基因Ct值。大鼠正常輸卵管組織作為對照組，EGFR、ICAM-1相對表達(dá)公式：folds=2-△△Ct其中△△Ct=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因）研究組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因）對照組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，用 ±s表示。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊時則用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性輸卵管炎大鼠模型建立情況 肉眼觀察可見輸卵管造模組較正常組明顯狹窄、質(zhì)地粗糙變脆、顏色灰白，不同程度粘連，部分輸卵管及其周圍可見積液或成膿。光鏡下病理：造模后經(jīng)HE染色輸卵管組織邊界模糊，纖維組織增生，排列紊亂的遠(yuǎn)端管腔纖毛，近端管壁角質(zhì)增生，粘連較多，管腔部分不通，可見漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及少量嗜酸性粒細(xì)胞等浸潤全層，見圖1。

圖1 輸卵管組織病理學(xué)改變（HE，×200）

2.2 抗炎通管湯對大鼠輸卵管上皮細(xì)胞EGFR、EGFR mRNA表達(dá)的影響 與正常組比，模型組及各給藥組EGFR、EGFR mRNA表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比，中、高劑量抗炎通管湯組EGFR、EGFR mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而金剛藤顆粒組、低劑量抗炎通管湯組EGFR、EGFR mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 抗炎通管湯對大鼠輸卵管上皮細(xì)胞ICAM-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響 與正常組比，模型組及各給藥組ICAM-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比，中、高劑量抗炎通管湯組ICAM-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而金剛藤顆粒組、低劑量抗炎通管湯組ICAM-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 各組大鼠輸卵管上皮細(xì)胞EGFR和EGFR mRNA表達(dá)量的比較（n=10， ±s）

表2 各組大鼠輸卵管上皮細(xì)胞ICAM-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)量比較（n=10， ±s）

3 討論

慢性輸卵管炎在歷代中醫(yī)文獻(xiàn)中并無明確病名記載，辯證分析后可以歸結(jié)為“斷緒”“腹痛”“帶下病”“癥瘕”[3]等。歷代醫(yī)家對本病的探討分析，概因濁毒蘊結(jié)體內(nèi)，致氣滯血瘀，故不通則痛，出現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)、腹痛等癥狀。治療上以解毒化濁，行氣活血為主，故筆者自擬抗炎通管湯以對癥下藥。方中皂角刺、白花蛇舌草、敗醬草解毒化濁為主藥；柴胡歸于肝經(jīng)，長于行氣解郁，川芎“氣中血藥”，行氣且能活血止痛，二者共奏行氣止痛之功；穿山甲、地龍、丹參、莪術(shù)祛瘀活血，通絡(luò)止痛；牡蠣、鱉甲、浙貝母化痰散結(jié)；黃芪固本扶正。全方共奏解毒化濁，通瘀散滯，使沖任調(diào)暢，從而實現(xiàn)抗炎通絡(luò)、調(diào)經(jīng)助孕的目的。

EGFR作為膜表面?zhèn)鞲衅鳎谌吮砥ぜ?xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞[4]中廣泛表達(dá)，具有酪氨酸激酶活性。其介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用往往是多方向的，包括增殖、遷移、細(xì)胞分化和穩(wěn)定內(nèi)部環(huán)境等，以及細(xì)胞增殖，惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和變化[5]。EGFR表達(dá)增強，促使上皮細(xì)胞生長因子與受體形成復(fù)合物，從而影響上皮細(xì)胞和輸卵管上皮的增殖、分化，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。ICAM-1[6]又名CD54，是黏附分子中免疫球蛋白超家族成員，是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，介導(dǎo)了白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附過程，并遷移于組織與受損靶細(xì)胞結(jié)合。在受到如白介素1（interleukin，IL-1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等炎性細(xì)胞因子刺激或內(nèi)毒素等作用后，ICAM-1表達(dá)明顯增加，進(jìn)而加快白細(xì)胞的趨邊滾動和向內(nèi)皮下基質(zhì)的游走[7]。本研究結(jié)果顯示，EGFR和ICAM-1蛋白在正常組輸卵管上皮細(xì)胞中少量表達(dá)，而模型組EGFR、ICAM-1蛋白表達(dá)明顯升高。通過免疫組織化學(xué)和實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，中、高劑量抗炎通管湯組均能降低EGFR、EGFR mRNA、ICAM、ICAM-1 mRNA的表達(dá)，且高劑量組下降明顯，而低劑量組并不能有效降低其表達(dá)；實時熒光定量PCR與免疫組織化學(xué)檢測指標(biāo)的結(jié)果基本吻合。本研究結(jié)果表明EGFR在慢性輸卵管炎的發(fā)病中起著重要作用，炎性介質(zhì)及細(xì)菌感染均可以上調(diào)其表達(dá)，而抗炎通管湯能通過抑制其異常表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用；ICAM-1也參與了整個炎癥過程，抗炎通管湯通過抑制輸卵管組織ICAM-1蛋白的異常表達(dá)，阻斷或減輕炎癥及組織損傷，改善輸卵管的結(jié)構(gòu)和功能，且抗炎通管湯的療效與其濃度具有一定相關(guān)性。

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